對香豆酸上調BDNF及改善慢性束縛應激誘導小鼠記憶障礙的作用*

肖楚麗，謝一銘，李金成，彭麗文，肖志勇，于旭東 △

(1.邵陽學院基礎醫(yī)學院，湖南 邵陽 422000；2.南華大學附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421001)

應激是各種神經精神疾病的重要原因。隨著生活節(jié)奏的不斷加快，人類面臨著越來越大的生理和心理應激[1]。慢性應激一方面可導致各種精神疾病如抑郁、焦慮，另一方面可導致神經退行性疾病如認知障礙[2,3]。雖然越來越多的人面臨應激性記憶障礙的困擾，然而應激誘導記憶障礙的神經機制仍不清楚。

腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)及其原肌球蛋白激酶B(tyrosine kinase receptor B, TrkB)受體廣泛分布于哺乳動物大腦中。越來越多的證據表明，BDNF/TrkB信號在神經可塑性和記憶形成中起著重要作用[4-7]。此外，BDNF/TrkB還影響與應激相關的記憶表現[8]，如慢性應激導致BDNF表達降低，而藥物發(fā)揮抗應激同時伴隨BDNF的上調[9]。BDNF的作用主要通過TrkB介導。ANA-12是一種廣泛應用的TrKB受體拮抗劑，可選擇性直接與TrkB受體結合，抑制TrkB下游通路。其可阻斷 BNDF與TrkB受體的結合從而降低BDNF的作用。如，ANA-12可防止腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)介導的神經突增生；ANA-12可消除BDNF增加內向電流的作用[10]。

對香豆酸(p-Coumaric acid, p-CA)是一種衍生自芳香族氨基酸的苯丙酸[11],具有抗氧化和神經保護作用。最近研究表明，p-CA可上調BDNF并且改善抑郁樣行為[12]。然而p-CA在學習記憶中的作用卻研究滯緩，尤其是在應激性記憶障礙的作用并無報道。本文基于慢性束縛應激(chronic restraint stress , CRS)誘導的記憶障礙模型，探索p-CA對應激性記憶障礙的影響。此外，我們應用TrKB受體拮抗劑ANA-12觀察其對p-CA促記憶作用的影響，以期明確BDNF/TrkB信號是否介導p-CA的這種作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠(雄性，9周齡)購于湖南斯萊克有限公司，小鼠配對飼養(yǎng)在標準的環(huán)境下(溫度為(25±1)℃，濕度為(50±5)%, 晝夜周期為12 h，其中8：00-20：00為明)，小鼠自由飲水，攝食。實驗開始前實驗者撫摸小鼠7 d，每天3 min。所有實驗程序均完全按照美國國家衛(wèi)生研究院關于和使用實驗室動物的指南進行。

1.2 實驗儀器與試劑

Y型迷宮、新穎物體識別箱及其視頻采集系統均購于北京眾實迪創(chuàng)科技有限公司。BDNF 抗體、β-actin抗體均購于美國proteintech?；谥暗难芯縖12]，p-CA(阿拉丁，上海)分散于10%的吐溫80中，劑量為100 mg/kg；ANA-12(selleck，美國)分散于1% DMSO中，劑量為0.5 mg/kg[9]；以上藥物均經腹腔注射，藥物及溶媒的注射體積為10 ml/kg。

1.3 實驗設計

(1)p-CA對CRS應激小鼠學習記憶障礙的影響。小鼠隨機分成對照組(Control)，慢性束縛應激組(CRS)和慢性束縛應激+p-CA組(CRS+p-CA)，每組8只，其中慢性束縛應激小鼠每天接受4 h的束縛應激，連續(xù)束縛10 d，而對照組小鼠留在籠中不被打擾。第11日小鼠腹腔注射溶媒(10%吐溫80)或p-CA(100 mg/kg)，注射后2 h進行Y迷宮測試，注射后24 h進行新穎物體識別采樣，采樣后2 h進行新穎物體識別測試。實驗結束后斷頭取腦剝離海馬并檢測BDNF蛋白表達。

(2)ANA-12對p-CA改善CRS應激小鼠記憶障礙的影響。小鼠隨機分成慢性束縛應激組(CRS)，慢性束縛應激+ANA-12組(CRS+ANA-12)和慢性束縛應激+p-CA組(CRS+ p-CA)慢性束縛應激+p-CA +ANA-12組(CRS+ p-CA +ANA-12)。每組8只，4組小鼠每天接受4 h的束縛應激，連續(xù)束縛10 d。第11日小鼠腹腔注射溶媒(10%吐溫80)或p-CA(100 mg/kg)，ANA-12在p-CA注射前30 min給藥。注射后2 h進行Y迷宮測試，注射后24 h進行新穎物體識別采樣，采樣后2 h進行新穎物體識別測試。

1.4 慢性束縛應激(CRS)

小鼠被放入50 ml的離心管，離心管均勻分布直徑為4 mm的透氣孔，每天上午10:00開始束縛，每天束縛4 h，連續(xù)束縛10 d。

1.5 新穎物體識別測試(NOR)

新穎物體識別測試分為采樣和測試兩個階段，在采樣階段，小鼠自由探索兩個物體5 min。采樣結束后2 h進行測試階段，采樣階段的物體被隨機替換一個新的識別物體。小鼠自由探索兩個物體5 min。小鼠行為通過箱頂的攝像頭記錄并由熟練者雙盲分析。小鼠的鼻子距物體小于1 cm則視為探索。辨別指數(DI)=(新物體的探索時間-舊物體的探索時間)/(新物體的探索時間+舊物體的探索時間)。

1.6 Y迷宮測試

小鼠依次放入Y型迷宮(臂長40 cm，高15 cm)中5 min，迷宮上方攝像頭記錄小鼠行為。熟練者雙盲統計小鼠5 min內入臂的次序，并計算出正確交替率。一次交替定義為小鼠連續(xù)的3 次進入三個不同的臂，中間無重復進入。最大交替次數為總入臂次數減去2，正確交替率為實際交替次數除以最大交替次數。

1.7 Western blot 檢測BDNF蛋白表達

取海馬組織，提取蛋白并使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。電泳分離蛋白質，濕轉法轉膜，用1倍TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置1.5 h。分別加入BDNF抗體(滴度1∶300)及β-actin 抗體(滴度1∶5 000)，4℃孵育過夜。再加入辣根過氧化酶標記的二抗孵育2 h。用TBST 充分漂洗并與ECL化學發(fā)光試劑反應。曝光后掃描，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 對香豆酸改善慢性束縛應激誘導小鼠記憶障礙

2.1.1 Y迷宮 在Y迷宮測試中，與Control組相比，各組小鼠交替次數無顯著性差異(P>0.05), 而CRS組小鼠正確交替率顯著降低(P<0.05)；與CRS組相比，CRS+ p-CA組小鼠正確交替率顯著升高(P<0.05，表1)；這些結果表明p-CA改善CRS應激誘導小鼠Y迷宮記憶障礙。

Tab. 1 Effect of p-CA on memory deficit of Y-maze test induced by CRS in mice n=8)

2.1.2 新穎物體識別(NOR)測試 在NOR測試中，與Control組相比，各組小鼠在NOR采樣階段對兩物體的總探索時間和測試階段穿越格子數均無顯著性差異(P均>0.05)。而CRS組小鼠在測試階段的辨別指數顯著降低(P<0.05)；與CRS組相比，CRS+ p-CA組小鼠辨別指數顯著升高(P< 0.05，表2)；這些結果表明p-CA改善CRS應激誘導小鼠NOR記憶障礙。

Tab. 2 Effect of p-CA on memory deficit of NOR test induced by CRS in mice n=8)

2.1.3 BDNF蛋白表達 Western blot結果顯示，與Control組相比，CRS組小鼠海馬內BDNF蛋白表達顯著降低(P< 0.01)；與CRS組相比，CRS+ p-CA組小鼠海馬內BDNF蛋白表達顯著升高(P<0.01，圖1)。這些結果表明，p-CA上調CRS誘導小鼠海馬BDNF蛋白表達降低。

Fig. 1 p-CA reversed CRS-induced reduction of BDNF protein level n=3)

2.2 ANA-12阻斷對香豆酸對慢性束縛應激誘導小鼠記憶障礙的改善作用

2.2.1 Y迷宮 在Y迷宮測試中，與CRS組相比，各組小鼠交替次數無顯著性差異(P>0.05), 而CRS+ p-CA組小鼠正確交替率顯著升高(P<0.05)；與CRS+ p-CA組相比，CRS+ p-CA+ ANA-12組小鼠正確交替率顯著降低(P<0.05，表3)；這些結果表明ANA-12阻斷p-CA對CRS應激誘導小鼠Y迷宮記憶障礙的改善作用。

Tab. 3 Blocking effects of ANA-12 on p-CA improved memory deficit of Y-maze test in CRS mice n=8)

2.2.2 新穎物體識別測試 在NOR測試中，與CRS組相比，各組小鼠在NOR采樣階段對兩物體的總探索時間和測試階段穿越格子數均無顯著性差異(P均>0.05)。而CRS+ p-CA組小鼠在測試階段的辨別指數顯著升高(P<0.05)；與CRS+ p-CA組相比，CRS+p-CA+ANA-12組小鼠辨別指數顯著降低(P<0.05，表4)；這些結果表明ANA-12阻斷p-CA對CRS應激誘導小鼠NOR記憶障礙的改善作用。

Tab. 4 Blocking effects of ANA-12 on p-CA improved memory deficit of NOR test in CRS mice n=8)

3 討論

當前研究發(fā)現P-CA可升高CRS小鼠Y迷宮測試中小鼠正確交替率以及NOR測試中小鼠辨別指數。此外，考慮到海馬BDNF信號在學習記憶中的作用，本文檢測BDNF在海馬中的表達及TrkB受體拮抗劑ANA-12對P-CA改善CRS小鼠記憶障礙的作用。結果顯示，P-CA改善CRS小鼠BDNF表達降低，并且ANA-12阻斷P-CA對慢性束縛應激小鼠記憶障礙的改善作用。這些結果表明，P-CA改善慢性束縛應激誘導小鼠記憶障礙，并且這種作用依賴于BDNF的上調。

NOR測試利用動物對新物體的天然偏好來檢測動物的識別記憶，Y型迷宮常用于檢測動物的空間記憶。在慢性不可預測應激，慢性束縛應激均導致小鼠NOR與Y迷宮中小鼠學習記憶降低[13-15]。與這些發(fā)現一致，當前研究表明CRS導致小鼠NOR與Y迷宮中學習記憶障礙。P-CA是白藜蘆醇和柚皮素等不同類黃酮的前體，在多種中樞疾病中發(fā)揮神經保護作用。在腦缺血模型中，P-CA可改善小鼠腦缺血/再灌注損傷[16]。在抑郁模型中，50 mg/kg，75 mg/kg和100 mg/kg的P-CA經腹腔一次注射均可改善LPS誘導的大鼠強迫游泳測試及懸尾測試中的抑郁樣行為以及減輕炎癥反應[11]。藥代動力學上，p-CA在腸道中被快速吸收，與其他酚類化合物相比具有更高的生物利用度[17]，此外，我們未公開的結果顯示一次腹腔注射100 mg/kg的P-CA 30 min后可改善小鼠抑郁樣行為?；谝陨涎芯炕A，本研究采用100 mg/kg劑量的P-CA經腹腔注射一次后2 h進行記憶測試。結果顯示P-CA可改善CRS誘導小鼠NOR與Y迷宮中學習記憶障礙，這與P-CA改善東莨菪堿誘導大鼠被動回避測試和水迷宮測試中記憶障礙中的結果一致[18]。進一步支持P-CA的神經保護作用和擴展P-CA的促學習記憶作用。為排除活動度對實驗結果的影響，在Y迷宮及NOR測試中分別檢測小鼠的總交替次數和穿越格子數，結果顯示p-CA不影響小鼠的活動水平，表明p-CA改善CRS誘導小鼠記憶障礙不是通過影響小鼠的活動水平。

BDNF通過與TrkB 受體結合在學習記憶中起到重要作用。例如，最近的一項研究表明BDNF雜合突變小鼠在NOR和Y迷宮中記憶障礙[19]。慢性應激可導致海馬BDNF水平降低，而抗應激藥物可上調BDNF并且改善應激誘導記憶障礙[13,20]。此外，BDNF抗體和TrkB信號拮抗劑均可阻斷藥物對應激誘導記憶障礙的改善作用[9,13]。與這些研究一致，當前研究表明慢性束縛應激誘導BDNF表達降低，而p-CA上調BDNF并且改善應激誘導記憶障礙。ANA-12是一種廣泛應用的TrKB受體拮抗劑，其可阻斷 BNDF與TrkB受體的結合從而降低BDNF的作用。如ANA-12可阻斷Apelin-13上調BDNF后對應激性記憶障礙的改善作用[13]。一致的是，當前研究表明ANA-12阻斷p-CA對慢性束縛小鼠學習記憶降低的改善作用，提示BDNF/TrkB信號參與p-CA的對應激小鼠學習記憶障礙的改善作用。然而，為進一步明確BDNF的作用，應在今后的研究中，中樞注射BDNF抗體探索其能否阻斷p-CA對應激小鼠學習記憶障礙中的改善作用。

綜上，本研究基于CRS模型，觀察到p-CA可逆轉CRS應激誘導認知障礙，這一結果可能對應激性記憶障礙的藥物研發(fā)具有潛在價值；并且p-CA的這種作用可能依賴于BDNF蛋白表達的上調，但其更確切的機制仍需要在今后的研究中進一步探索。