miR-520a-3p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞因子分泌的信號(hào)通路*

劉紅艷, 魯啟洪, 黃楚鷹

(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 腫瘤放療中心, 恩施 445000；2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 恩施 445000；3.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院腫瘤一科, 恩施 445000)

宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在女性生殖道惡性腫瘤中排名第二[1]。每年全世界有近500,000例新病例，其中一半死于宮頸癌[2]。宮頸癌主要由持續(xù)感染高危人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)引起。在大多數(shù)情況下，HPV感染是自限性的，并且可以通過(guò)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答來(lái)根除。這表明免疫調(diào)節(jié)可能在宮頸癌發(fā)生中起重要作用。炎癥是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵組成部分，因?yàn)榘┌Y是從感染和炎癥部位，尤其是慢性炎癥部位生長(zhǎng)的。已有研究表明宮頸癌細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子，并促進(jìn)腫瘤的生存、遷移和增殖等過(guò)程[3]。因此，探討宮頸癌細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的分子機(jī)制對(duì)治療腫瘤有積極意義。核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)，包括細(xì)胞因子，它們?cè)诩?xì)胞凋亡，腫瘤發(fā)生，各種自身免疫疾病和炎癥中起關(guān)鍵作用[4]。miR-520a-3p能夠調(diào)控多種癌細(xì)胞的增殖，凋亡和轉(zhuǎn)移[5, 6]。此外，Zhu H等人[7]通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-520a-3p在宮頸癌中表達(dá)量較低。然而，其在宮頸癌中的作用尚不明確。目前，從診斷到預(yù)后，可能在治療和預(yù)防宮頸癌中發(fā)揮作用，所有抗癌方法都在評(píng)估細(xì)胞因子的作用[8-10]。基于此，本研究以宮頸癌HELA細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探討miR-520a-3p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞分泌粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, GCSF), 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 白介素2(interleukin-2, IL-2), 白介素3(interleukin-3, IL-3), 白介素4(interleukin-4, IL-4), 白介素5(interleukin-5, IL-5), 白介素6(interleukin-6, IL-6), 白介素9(interleukin-9, IL-9), 白介素10(interleukin-10, IL-10), 白介素12 p40(interleukin-12 p40, IL-12 p40),白介素12 p70(interleukin-12 p70, IL-12 p70), 白介素13(interleukin-13, IL-13), 白介素17(interleukin-17, IL-17), 干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ), 單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1), 調(diào)控T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated on activation normal T cell expressed and secreted, RANTES), 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等細(xì)胞因子的分子機(jī)制，為治療宮頸癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

RELA, GAPDH抗體購(gòu)自cst公司(貨號(hào)：59674, 5174)。宮頸癌HELA細(xì)胞購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?貨號(hào)：Y-01663)。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司(貨號(hào)：R1145-500ML)，胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(貨號(hào)：10099-133)。pMir-Glo miRNA功能研究載體購(gòu)自上海海吉浩格生物科技有限公司(貨號(hào)：HH-LUC-016)。蛋白酶抑制劑Cocktail(不含EDTA, mini片劑)購(gòu)自bimake公司(貨號(hào)：B14011)。PBS購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號(hào)：E607008)。青鏈霉素混合液(100×)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)：P1400)。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號(hào)：WB-0081)。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司(貨號(hào)：SLDL-100)。蛋白裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：P0013)。miRNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上?；苌钌锟萍加邢薰?貨號(hào)：409-10)。LPS購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(貨號(hào)：S11060)。miR-520a-3p的qPCR引物，miRNA NC，miR-520a-3p mimics，miR-520a-3p inhibitor均有上海生工合成，序列參考Zhang R 等人[5]。GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, RANTES, TNFα的ELISA試劑盒購(gòu)自上海喬羽生物科技有限公司(貨號(hào)：QN-PS0040, QY-BM11154, QY-x0605P, QY-BM10220, QN-PS0051, QN-PS0050, QY-BM10211, QY-BM10205, QY-BM10156, QY-BM10178, QY-BM10175, QY-BM10172, QN-PS0179, QY-BM10168, QY-Q11142, QY-BM11185, QY-BM10200)。MCP-5的ELISA試劑盒購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司(貨號(hào)：SEC075Mu-1)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與LPS處理

宮頸癌HELA細(xì)胞在含有10%FBS和1%P/S的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將所有細(xì)胞維持在37℃的含5%CO2的培養(yǎng)箱中。將miR-520a-3p mimics或miR-520a-3p inhibitor與miRNA轉(zhuǎn)染試劑混合，靜止大約20 min后，緩緩滴入HELA細(xì)胞。將HELA細(xì)胞與500 ng/ml的LPS一起溫育20 h后進(jìn)行下游試驗(yàn)。其中，轉(zhuǎn)染miRNA NC的為對(duì)照組(control)、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p mimics的為過(guò)表達(dá)組(overpression of miR-520a-3p)、LPS處理的為L(zhǎng)PS處理組(LPS treatment)、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p mimics并用LPS處理的為L(zhǎng)PS處理過(guò)表達(dá)組(LPS treatment + overpression of miR-520a-3p)、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p inhibitor的為過(guò)表達(dá)組(Knockdown of miR-520a-3p)、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p inhibitor并用LPS處理的為L(zhǎng)PS處理敲低組(LPS treatment + Knockdown of miR-520a-3p)。

1.3 RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TRIzol試劑提取總RNA，并進(jìn)行cDNA合成。用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR。將轉(zhuǎn)錄水平標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的水平，檢測(cè)基因表達(dá)水平。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)

將RELA的3’UTR克隆進(jìn)pMir-Glo質(zhì)粒，同時(shí)克隆RELA的3’UTR的UG突變進(jìn)pMir-Glo質(zhì)粒。將每孔總共5×104個(gè)HELA細(xì)胞接種在24孔板中。培養(yǎng)24 h后，用含有200 ng/ml雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和40 nmol/L miR-520a-3p mimics混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒在轉(zhuǎn)染后24 h通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量熒光素酶活性。所有轉(zhuǎn)染獨(dú)立重復(fù)至少三次。

1.5 免疫印跡試驗(yàn)

使用RIPA裂解緩沖液[50 mmol/l Tris-HCl(pH7.4)，150 mmol/l NaCl，1%Nonidet P-40, 0.5%脫氧膽酸鈉]從細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)，并使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量[11]。使用多克隆抗RELA(1∶3 000), GAPDH(1∶6 000)抗體作為一抗、抗兔和抗小鼠IgG為二抗。使用ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

用涂層緩沖液中的抗原/分析物溶液充分涂覆微量滴定板。蓋上培養(yǎng)板，在4℃下孵育過(guò)夜。用300 μl洗滌緩沖液洗滌板三次。將阻斷緩沖液添加到板中。在37℃孵育1 h。準(zhǔn)備分析物抗體混合物用于樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。將分析物和標(biāo)準(zhǔn)混合物添加到選定的孔中。在37℃孵育1 h。用300 μl洗滌緩沖液洗滌三次。將酶綴合的二抗添加到每個(gè)孔中。在37℃孵育1 h。用300 μl洗滌緩沖液洗滌三次。將底物溶液添加到選定的孔中。在室溫下孵育直至觀察到所需的顏色變化。添加反應(yīng)終止液。讀取吸光度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-520a-3p過(guò)表達(dá)后，野生型和突變型miR-520a-3p的3’UTR的熒光素酶活性

Targetscan在線(xiàn)工具分析結(jié)果表明，miR-520a-3p與RELA的3’UTR高度匹配，且匹配區(qū)域位于3’UTR的1268-1275位置(圖1)。將RELA的3’UTR中與miR-520a-3p相匹配區(qū)域中的U均突變?yōu)镃、C均突變?yōu)锳并插入pMir-Glo質(zhì)粒中，此為突變型。與突變型相比，野生型RELA的相對(duì)熒光素酶活性下降(100±6vs17±3,P<0.05，圖2)。

Fig. 1 miR-520a-3p and NF-κB complex subunit RELA highly matched

Fig. 2 Luciferase activity of 3 'UTR of wild and mutant miR-520a-3p after overexpression of miR-520a-3p

2.2 過(guò)表達(dá)miR-520a-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞HELA因子分泌的影響

在宮頸癌HELA細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-520a-3p mimics后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-520a-3p水平發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-520a-3p組的miR-520a-3p基因表達(dá)水平上升(1.01±0.10vs3.59±0.66,P<0.05)，同時(shí)通過(guò)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-520a-3p組的NF-kB復(fù)合體亞基RELA的蛋白表達(dá)水平下降(圖3)。使用LPS激活NF-kB信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和過(guò)表達(dá)miR-520a-3p組相比，宮頸癌HELA細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNF-α的蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)，但是LPS處理的同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-520a-3p后，相比于LPS處理組，宮頸癌HELA細(xì)胞分泌的這些細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05，表1)。

Fig. 3 Expression of the subunit RELA of the NF-kB complex after overexpression of miR-520a-3p

Tab. 1 Effects of overexpression of miR-520a-3p on HELA factor secretion in cervical cancer cells

2.3 敲低miR-520a-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞HELA因子分泌的影響

在宮頸癌HELA細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-520a-3p inhibitor后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-520a-3p水平結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，敲低miR-520a-3p組的miR-520a-3p基因表達(dá)水平下降(0.99±0.11vs0.35±0.05，P<0.05)，同時(shí)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，敲低miR-520a-3p組的NF-kB復(fù)合體亞基RELA的蛋白表達(dá)水平上升(圖4)。使用LPS激活NF-kB信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和敲低miR-520a-3p組相比，宮頸癌HELA細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNFα的蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)，但是LPS處理的同時(shí)敲低miR-520a-3p后，相比于LPS處理組，宮頸癌HELA細(xì)胞分泌的這些細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步上升(P<0.05，表2)。

Fig. 4 Expression of subunit RELA in the NF-kB complex after miR-520a-3p knockdown

3 討論

在本研究中發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌HELA細(xì)胞中miR-520a-3p靶向RELA的3’UTR。Zhang R等人[5]報(bào)道m(xù)iR-520a-3p能夠靶向EGFR調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移，細(xì)胞凋亡。Li J等人[12]發(fā)現(xiàn)，miR-520a-3p能夠靶向CCND1和CD44調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲。因此，miR-520a-3p是一個(gè)與多種癌癥相關(guān)的分子，能夠調(diào)控癌細(xì)胞的生命活動(dòng)。

Tab. 2 Effect of miR-520a-3p knockdown on HELA factor secretion in cervical cancer cells

細(xì)胞因子也稱(chēng)為白細(xì)胞介素，單核因子，淋巴因子，趨化因子和生長(zhǎng)因子[13-15]。本研究結(jié)果表明，LPS激活NF-kB信號(hào)通路后，宮頸癌HELA細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNF-α的水平顯著上升。NF-κB在大多數(shù)細(xì)胞中作為p50和p65亞基的同源二聚體或異二聚體復(fù)合物存在，并且在與NF-κB抑制蛋白(I-κB)相關(guān)的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中保持無(wú)活性[16]。NF-κB被激活以響應(yīng)各種炎癥刺激分泌細(xì)胞因子，包括細(xì)菌LPS及其通過(guò)增加與細(xì)胞溶質(zhì)IκB蛋白減少相關(guān)的核p65蛋白誘導(dǎo)的NF-κB活化。在多種疾病中，NF-κB能夠調(diào)控多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX2、趨化因子、粘附分子、集落刺激因子，因此NF-κB是治療各種疾病的重要靶點(diǎn)。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-520a-3p后，RELA的表達(dá)水平顯著下降，宮頸癌HELA細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平顯著下降；敲低miR-520a-3p后，RELA的表達(dá)水平上升，宮頸癌HELA細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平顯著上升。最近的文獻(xiàn)揭示一些細(xì)胞因子的失調(diào)與宮頸癌前病變的發(fā)生率，從癌前期到“原位”癌癥的進(jìn)展，進(jìn)一步侵襲以及末期轉(zhuǎn)移之間的顯著關(guān)聯(lián)[17]。最初，細(xì)胞因子被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)中的信使分子，將白細(xì)胞引導(dǎo)至炎癥部位。然而，當(dāng)失調(diào)時(shí)，細(xì)胞因子與大多數(shù)腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，可能在惡性轉(zhuǎn)化，增殖，存活，血管生成，侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用?，F(xiàn)在已經(jīng)鑒定近50種細(xì)胞因子，其中一些或它們的受體在宮頸癌的癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中顯著改變[18]。細(xì)胞因子如GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNF-α等已被證明可作為潛在的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估侵襲性癌癥和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[19]。許多細(xì)胞因子在宮頸癌前期和癌癥中顯著改變，在患有轉(zhuǎn)移的晚期癌癥中更是如此。其中一些例如IL-6，IL-17，IL-8與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)[20]，而一些與抑制HPV復(fù)制和抑制腫瘤相關(guān)，例如RANTES，TNFα，IFNγ。目前，幾種miRNA靶向治療已在臨床應(yīng)用，包括腫瘤抑制因子miRNA miR-34的模擬物，已經(jīng)進(jìn)行治療癌癥的I期臨床試驗(yàn)，以及針對(duì)miR-122的antimiRs，已經(jīng)進(jìn)行治療肝炎的II期臨床試驗(yàn)[21]。因此，通過(guò)體外合成的miR-520a-3p模擬物可能抑制RELA的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞因子的分泌，抑制腫瘤的生存、遷移和增殖等過(guò)程，延長(zhǎng)宮頸癌患者生存率。