鈣激活氯通道蛋白ANO1在心肌成纖維細胞分化過程中的表達及其鈣激活氯通道電生理特性變化*

田香勤，譚朝陽，李娜娜，常玉巧，張愛梅，周 穎，馬克濤，司軍強Δ

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，新疆 石河子 832000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省高等學(xué)校組織再生重點開放實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.中國人民解放軍克拉瑪依軍分區(qū)，新疆 克拉瑪依 834000；4.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000)

自從2008年三個實驗室分別在Nature，Science和Cell雜志報道證實，ANO1(anoctamin-1，亦稱TMEM16A, DOG1, ORAOV2或TAOS2)是鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels, CaCCs)的分子基礎(chǔ)以來[1-3]，ANO1成為目前離子通道研究的熱點。ANO1蛋白包含10個跨膜結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)為CaCCs生理和藥理學(xué)功能，對陰離子選擇性順序為NO3->I->Br->Cl->F-，與報道的內(nèi)源性CaCCs具有相似的陰離子選擇特性[1]。ANO1在胰腺腺泡細胞、視網(wǎng)膜細胞層、近端腎小管、背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元、頜下腺感覺神經(jīng)元、氣管上皮、血管平滑肌、心臟、部分腫瘤等均有表達[4]。作為anoctamin氯離子通道家族中的成員，ANO1蛋白參與跨上皮細胞離子轉(zhuǎn)運、平滑肌收縮、嗅覺產(chǎn)生、光感受、傷害性感受和神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)，以及上皮分泌、細胞的增殖遷移、氣道粘液分泌、唾液分泌、消化道慢波電位形成和血管緊張性調(diào)節(jié)等病理生理過程[5]。

心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)約占心肌總細胞數(shù)的60%～70%，它是細胞外基質(zhì)組分的重要來源[6]。CFs在健康心臟中多以靜止形式存在，但在炎癥、創(chuàng)傷等因素作用下分化為成肌纖維細胞(myofibroblasts，MFs)，其典型特征是α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達增高，細胞的增殖、分泌和遷移能力增強[6,7]。同時細胞內(nèi)離子濃度發(fā)生改變，特別是氯離子濃度的改變對細胞體積和細胞周期產(chǎn)生影響[8]。有報道CFs中存在ANO1的表達，并且CFs中的鈣激活氯通道電流(Ca2+-activated Cl-current,ICl(Ca))在AngII刺激作用下明顯增強[9]。但ANO1在CFs分化為MFs過程中的表達變化及其作用機制尚不清楚。心肌成纖維細胞的體外培養(yǎng)區(qū)別于體內(nèi)穩(wěn)定環(huán)境，培養(yǎng)48 h的CFs已經(jīng)達到對數(shù)生長期，其中大多數(shù)細胞已經(jīng)分化為MFs，其增殖、遷移和膠原分泌能力增強[10]。本研究以剛貼壁培養(yǎng)的SD乳鼠原代CFs和傳至第三代已分化為MFs的細胞為研究對象，利用全細胞膜片鉗、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)探索ANO1在CFs分化為MFs過程中的表達規(guī)律及電生理特征，進一步拓展對ANO1功能的認識。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

低糖培養(yǎng)基(貨號：SH30021.01)購自HyClone公司；胎牛血清(貨號：1600-044)購自Gibico公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：P0012S)購自Beyotime公司；小鼠Anti-α-SMA抗體(貨號：BM0002)購自武漢博士德生物公司；青鏈霉素溶液(貨號：C0222)、羊抗兔CY3抗體(貨號：A0516)和FITC標記羊抗小鼠IgG(貨號：A0568)購自Beyotime公司；胰酶(含酚紅，EDTA)(貨號：T1320)購自Solarbio生物公司；Anti-TMEM16A抗體(貨號：ab53213)購自abcam公司；NaATP(貨號：A2383)、CaCCinh-A01(貨號：SML0916)和T16Ainh-A01(貨號：SML0493)均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 原代心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法

無菌條件下取新生SD大鼠心臟(實驗動物來源于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物合格證號：SYXK(豫)2009-0002)，用預(yù)冷的低糖DMEM培養(yǎng)基沖洗5次，除去心房組織和心臟內(nèi)血液，用眼科剪將心臟剪成約1 mm3小塊，加入0.1%的Ⅱ型膠原酶和0.125%胰蛋白酶(二者體積比為3∶2)，放置于37℃培養(yǎng)箱，每4 min吹打一次，吸取上清放入加有10%胎牛血清培養(yǎng)基，中和消化酶活性，剩余組織塊加入聯(lián)合酶繼續(xù)消化至組織塊完全消化松軟，加入5 ml培養(yǎng)基吹打使細胞脫落，收集所有消化后的細胞，采用200 μm孔的濾器過濾，1 000 r/min 離心5 min，用完全培養(yǎng)基懸浮沉淀細胞并接種，45 min后，棄上清，貼壁細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 心肌成纖維細胞熒光標記方法

培養(yǎng)細胞于48孔板，4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min，加入0.3%的Triton透膜20 min，10%山羊血清封閉，室溫孵育30 min，吸棄山羊血清直接滴加一抗，放于濕盒中4℃孵育過夜，第2日復(fù)溫20 min，浸洗后滴加1∶500的FITC標記山羊抗小鼠或Cy3標記山羊抗兔二抗，室溫孵育1～1.5 h，DAPI復(fù)染細胞核7 min，陰性對照為PBS代替一抗，各步驟間均用PBS洗3次，每次5 min。采用激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖片。其中纖維細胞鑒定用vimentin(1∶500兔抗大鼠抗體)抗體單標記，雙標記采用ANO1一抗(1∶1兔抗大鼠ANO1抗體)和α-SMA一抗(1∶50小鼠抗大鼠α-SMA抗體)進行，孵育后同時加入相應(yīng)的二抗。

1.4 全細胞膜片鉗檢測鈣激活氯通道電流

采用差速貼壁分離心肌成纖維細胞，無菌狀態(tài)下置于培養(yǎng)箱45 min備用，傳代細胞用胰酶消化，靜置貼壁后使用。采用P-2000電極拉制儀將帶芯硼硅酸鹽玻璃毛坯(Sutter Instrument公司生產(chǎn))拉制成微電極。選取微電極的電阻值為2～8 MΩ，給予微電極內(nèi)部一定負壓，同時將鉗制電位逐步調(diào)節(jié)至-70 mV，待細胞與電極間形成GΩ封接后，用嘴吸破膜法或同時輔助以電擊破膜法破膜(膜片鉗放大器提供的Zap功能)。破膜后，電阻值仍維持在GΩ以上的細胞用于膜片鉗檢測。

在電壓鉗模式下(鉗制電壓-70 mV)，記錄膜電容(membrane capacity, Mc)，給予細胞一個斜坡刺激(-100 mV到100 mV，1000 ms)，用以測量并計算細胞的靜息電位(resting potential, RP)；給予細胞步階刺激(-100 mV到100 mV，步階20 mV)，用以測量并計算電流密度(current density, CD)。記錄的信號經(jīng)MultiClamp 700B放大器放大，給予10 kHz的濾波，并由Axon Digidata 1550A數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換，采樣頻率為10～20 kHz。

膜片鉗用溶液配制：膜片鉗用細胞外液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.9，CaCl22.2，MgCl21.2，glucose 14，HEPES 10，用1 mol/L的NaOH調(diào)至pH值7.4左右，滲透壓控制在320～330 mOsmol/kg；膜片鉗用電極內(nèi)液：CsCl 120 mmol/L，Tetraethylammonium-Cl 20 mmol/L MgCl22.8 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，(pCa 6.0)CaCl24.25 mmol/L，ATP Na22 mmol/L，用1 mol/L CsOH調(diào)節(jié)pH值為7.2，滲透壓控制在320～330 mOsmol/kg[11]。

1.5 Western blot 檢測蛋白表達

培養(yǎng)細胞用PBS清洗3遍后加入裂解液，六孔板加裂解液70 μl/well，反復(fù)吹打數(shù)次使細胞破碎，用細胞刮收集細胞破碎液于1.5 ml離心管，冰上放置10 min，充分裂解后離心提取蛋白。蛋白濃度測定后加入5×蛋白上樣緩沖液以4∶1的比例混勻，95℃加熱5 min使蛋白變性，冷卻至室溫后，分裝放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

配制8%分離膠和上層濃縮膠，采用穩(wěn)壓電泳，濃縮膠80 V，1 h后改為分離膠120 V至電泳結(jié)束。轉(zhuǎn)膜采用0.2 A持續(xù)轉(zhuǎn)1.5 h，用TBST洗膜10 min，5%脫脂奶粉孵育1 h，加入一抗4℃孵育過夜。次日復(fù)溫30 min后用TBST溶液洗膜，搖床洗3次，每次10 min，二抗常溫下孵育1.5 h，加入曝光試劑后利用Amersham Imager 600曝光成像系統(tǒng)采集圖片，利用圖像分析軟件Image J 1.48v測定電泳條帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CFs和MFs的鑒定

采用vimentin蛋白對心肌CFs純度進行鑒定，熒光顯微鏡200倍下隨機選取5個視野，對vimentin標記細胞和所有細胞核進行計數(shù)。結(jié)果顯示，45 min差速貼壁的細胞多呈圓形，部分細胞伸出偽足貼壁，細胞純度達到(93±2)%；CFs傳至第3代時，細胞呈三角形或梭形，相比剛貼壁細胞體積較大，細胞純度達到(96±3)%(圖1A)。剛貼壁細胞大部分不表達α-SMA，傳至第三代的細胞大部分強陽性表達α-SMA，表明已分化為MFs(圖1B，圖1見彩圖頁Ⅱ)。

2.2 鈣激活氯通道電流特性

采用全細胞膜片鉗記錄心肌成纖維細胞ICl(Ca)，細胞鉗制電位設(shè)置為-70 mV，當測試電位由-100 mV逐漸變化到+100 mV(步階電壓為20 mV)時，所得到的ICl(Ca)具有明顯的外向整流特征，這一電流特征與經(jīng)典的ICl(Ca)相符合；在+20 mv后，Icl(ca)隨著刺激電壓的增加而增大，向剛分離的心肌成纖維細胞中分別加入10 μmol/L的T16Ainh-A01和30 μmol/L的CaCCinh-A01后，全細胞膜片鉗記錄得到的ICl(Ca)幅度明顯減小，給予外液沖洗細胞，電流恢復(fù)為原來的幅度，表明該實驗條件下膜片鉗檢測為Icl(ca)(圖2)。

Fig. 2 The effects of inhibitors on CaCCs currents in CFs

2.3 CFs和MFs鈣激活氯通道電流差異

CFs和MFs的靜息電位差異不明顯，但新鮮組織分離的剛貼壁CFs細胞鈣激活氯通道電流密度遠高于MFs細胞，+40 mv至+100 mv電流密度組間差異顯著(圖3)。

Fig. 3 The detection of CaCCs currents in CFs of the early adherent and MFs

2.4 ANO1在CFs和MFs的表達特征

對剛分離貼壁的原代心肌CFs和MFs分別進行ANO1抗體和α-SMA抗體標記。結(jié)果顯示，剛貼壁分離的心肌成纖維細胞呈橢圓形，細胞尚未完全伸展粘附于培養(yǎng)板，大部分細胞不表達α-SMA(FITC綠色熒光標記)，僅小部分有微弱表達，ANO1(Cy3紅色熒光標記)在細胞核處呈較弱表達；MFs呈三角形或梭形，ANO1表達明顯增強，主要表達于細胞核和近核膜的胞質(zhì)區(qū)域，同時出現(xiàn)細胞膜少量表達，α-SMA呈線狀分布于細胞質(zhì)，其表達強度和ANO1趨勢一致(圖4A)。Western blot檢測結(jié)果顯示，剛貼壁培養(yǎng)的CFs中ANO1和α-SMA的表達(灰度值分別為0.436±0.009和0.106±0.007)均低于MFs(灰度值分別為0.753±0.036和0.979± 0.012)(P<0.01，圖4B，圖4見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

膜片鉗技術(shù)已成為研究離子通道功能的重要工具[12]。離子通道蛋白分子及其基因序列的確定為研究離子通道的功能奠定重要基礎(chǔ)，進一步補充離子通道電生理研究[13]。Ca2+作為細胞內(nèi)第二信使，調(diào)節(jié)眾多的離子通道和信號通路，其中CaCCs是Ca2+依賴性的Cl-通道，受細胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)[14]。在Ca2+濃度較低時，呈現(xiàn)外向整流特性，當存在高濃度Ca2+時卻呈線性的電流-電壓關(guān)系[15]。本試驗中采用Ca2+濃度為4.25 mmol/L，電流表現(xiàn)為外向整流特征。另外，CaCCinh-A01和T16Ainh-A01是目前研究證實較為有效的CaCCs抑制劑，通常用于離子通道中CaCCs/ANO1的電生理檢測[16]。本試驗將以上兩種抑制劑作用于新鮮分離培養(yǎng)的CFs，發(fā)現(xiàn)兩者均能對CFs中的電流產(chǎn)生抑制，表明本試驗所激發(fā)的電流為鈣激活氯通道電流。

本研究發(fā)現(xiàn)，CFs在分離培養(yǎng)45 min左右即可牢固貼壁，在剛貼壁的CFs中α-SMA表達較弱，說明尚未活化為MFs。CFs在體外傳代培養(yǎng)至第三代時，細胞內(nèi)α-SMA的表達明顯增強，表明CFs已經(jīng)分化為MFs。Western blot和熒光標記結(jié)果顯示，盡管MFs中ANO1蛋白含量較高，但其ICl(Ca)卻出現(xiàn)減少的情況，從本實驗結(jié)果推測其原因可能存在以下兩個方面：首先，盡管細胞總體ANO1蛋白增加，但其主要表達于細胞核內(nèi)、細胞核周的細胞質(zhì)及細胞器中的蛋白明顯增加，細胞膜表達變化不明顯，在CFs分化過程中細胞膜上的ANO1蛋白亦可能存在不同的構(gòu)象來調(diào)節(jié)離子通道的功能；其次，電流大小的改變與細胞功能密切相關(guān)，剛貼壁分離的CFs產(chǎn)生的ICl(Ca)較大，而MFs電流變小，ICl(Ca)具有外向整流的特征，CaCCs通道開放使得Cl-進入細胞內(nèi)。細胞的去極化有利于細胞的增殖[17]，ICl(Ca)減弱使細胞去極化，從而促進CFs的增殖。

另外，ANO1在CFs中的表達分布特征也暗示ANO1不僅在細胞膜上發(fā)揮離子通道作用，在細胞核膜或細胞器膜也可能具有離子通道功能。目前許多離子通道的分子基礎(chǔ)及功能尚未明確，從而導(dǎo)致對特定生理過程或疾病相關(guān)的通道類型產(chǎn)生分歧[18]。ANO1作為鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)，與細胞的增殖密切相關(guān)，其所發(fā)揮的作用可能不僅僅作為CaCCs通道的分子基礎(chǔ)，也可能發(fā)揮調(diào)節(jié)因子的作用。已有研究證實ANO1在一些腫瘤細胞中呈高表達，并能夠通過MAPK途徑調(diào)節(jié)腫瘤細胞的分裂和生長[19]。氯離子是細胞功能的重要調(diào)節(jié)成分，在消化、肌肉活動、體液調(diào)節(jié)、維持細胞內(nèi)的電子通透性和酸堿平衡等方面發(fā)揮著重要作用[20]。ANO1作為鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)，其在正常靜止的心肌成纖維細胞中表達較弱，暗示鈣激活氯通道在CFs正常生理狀態(tài)下可能并未發(fā)揮太大功能。CFs分化為MFs后ANO1表達增強，從而調(diào)控細胞內(nèi)氯離子的濃度及其分布，對細胞的功能產(chǎn)生影響。

CFs在心肌梗死、心力衰竭、高血壓等病理狀態(tài)下轉(zhuǎn)化為MFs，在此過程中，細胞的增殖、遷移和分泌能力增強[21]。本研究初步闡明ANO1在CFs和MFs細胞的表達特征及其與CaCCs電流變化的關(guān)系，為下一步深入研究ANO1在CFs增殖、遷移、分泌及心肌纖維化進程中的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。