外泌體對(duì)骨愈合作用的研究進(jìn)展

王特，蔡樂(lè)益，盧迪，陳華

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，浙江 溫州 325027）

在社會(huì)經(jīng)濟(jì)現(xiàn)代化發(fā)展下，創(chuàng)傷性骨折的發(fā)生率顯著增高，據(jù)報(bào)道由交通事故因素導(dǎo)致的骨折占總體因素的45%[1]。骨折不愈合是骨折臨床治療中的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，同時(shí)也是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)有5%～10%的骨折可能發(fā)展成為骨折不愈合，從而使患者恢復(fù)功能的時(shí)間增加，造成患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及醫(yī)療資源的浪費(fèi)[2]。此外，糖尿病性和老年性骨質(zhì)疏松的增加也能導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)的破壞，顯著增加骨折風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也影響骨折愈合的過(guò)程[3]。因此，如何有效地促進(jìn)骨折愈合，治療骨折不愈合仍是所有骨科醫(yī)師面臨的巨大挑戰(zhàn)。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究指向具有多種生理功能的外泌體領(lǐng)域。外泌體由活體細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其起源于晚期細(xì)胞內(nèi)吞體囊泡，與細(xì)胞膜融合后往外釋放的膜性囊泡，多種細(xì)胞均能分泌，內(nèi)含有特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子或遺傳物質(zhì)，直徑40～100 nm[4-5]。研究表明，外泌體通過(guò)介導(dǎo)不同細(xì)胞間的通訊參與呈遞抗原、影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)組織修復(fù)等多種病理生理學(xué)過(guò)程，能夠有效刺激機(jī)體器官、組織，包括心臟、肺臟、腎臟、骨組織、肉芽組織等的再生，在特定疾病的早期診斷、治療及精準(zhǔn)化靶向治療等方面展現(xiàn)出較大的優(yōu)勢(shì)[6-10]。本文將近年來(lái)外泌體在骨組織、血管骨骼肌等方面的文獻(xiàn)報(bào)道加以整理，以期為外泌體的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用提供參考。

1 外泌體的基本概要

1983年，在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了外泌體[11-12]，1987年JOHNSTONE等[13]將這種特異性囊泡命名為“exosome”。最初，學(xué)者認(rèn)為這種膜性囊泡是一種實(shí)驗(yàn)的人工成分、廢棄物或者機(jī)體壞死細(xì)胞的殘留組織[11]。直到20世紀(jì)90年代，ZITVOGEL等[14]和RAPOSO等[15]報(bào)道指出外泌體極有可能是不同細(xì)胞之間參與通訊的一種方式。

不同細(xì)胞分泌的外泌體含有特異性蛋白分子（Alix、LAMP-2、CD63、CD9、Flotillin-1等），同時(shí)還包含許多關(guān)鍵分子，發(fā)揮不同的功能[16]。通過(guò)外泌體脂質(zhì)膜中具有識(shí)別作用的蛋白，能夠識(shí)別不同的靶向細(xì)胞，從而發(fā)揮生理作用，因此可以運(yùn)載特定的藥物，靶向介導(dǎo)治療特定的疾病。然而在機(jī)體處于損傷狀態(tài)中或者外界不良的刺激等病理情況下，細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體也會(huì)產(chǎn)生不利影響，加大損失，甚至加快疾病進(jìn)程[17]。

據(jù)目前研究顯示，人類(lèi)間質(zhì)充干細(xì)胞分泌的外泌體參與保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[18]，緩解肢體缺血[19]，促進(jìn)創(chuàng)口愈合[20]，調(diào)節(jié)移植物抗宿主 病[21]，緩和腎臟損傷[22]，刺激肝臟再生[23]，抑制肺高壓[24]，促進(jìn)視網(wǎng)膜修復(fù)[25]，參與軟骨組織[26]和骨組織再生[19]。

2 外泌體的提取與鑒定

人體體內(nèi)多種細(xì)胞能夠分泌外泌體，如網(wǎng)織紅細(xì)胞[11]、樹(shù)突狀細(xì)胞[27]、B細(xì)胞[15]、T細(xì)胞[28]、肥大細(xì)胞[29]、上皮細(xì)胞[30]和腫瘤細(xì)胞[31]。通過(guò)運(yùn)輸特定的編碼RNA[32]、非編碼RNA[33]、蛋白質(zhì)[34]、抗原呈遞分子[35]和DNA[36]，外泌體參與細(xì)胞間的通訊，保護(hù)特定內(nèi)容物，以調(diào)節(jié)機(jī)體不同細(xì)胞的活性。

目前，外泌體提取方法較多，方式各具特 色[37-40]。提取外泌體的方法、具體提取原理及其優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。通常采用以下方法鑒定所提取的外泌體。第一種是電鏡下直視外泌體的形態(tài)。將提取所得的外泌體溶液滴加至100目載樣銅網(wǎng)上，靜置于室溫中1 min，后滴加染色劑（磷鎢酸鈉溶液或乙酸雙氧鈾溶液），染色1 min后即可觀察。第2種是免疫學(xué)方法。采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、ELISA等方法檢測(cè)外泌體表面特異蛋白膜，如轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白、熱休克蛋白、CD9、CD63等，根據(jù)測(cè)定抗原抗體復(fù)合物上的特殊標(biāo)記的量即可得知所檢測(cè)外泌體量。另外還可以采用PCR法、原子力顯微鏡、圖像流技術(shù)等[41]。目前方法較多，研究中常常會(huì)采用2～3種方法聯(lián)合測(cè)定，保證外泌體的純度。

表1 外泌體的提取方法總結(jié)

3 外泌體在成骨、破骨細(xì)胞中的作用

近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者報(bào)道了骨重建過(guò)程中外泌體發(fā)揮的作用。在骨愈合的微環(huán)境中，參與骨愈合的細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)控重建過(guò)程。BEHERA等[42]研究指出，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)分泌特異性外泌體，將不同的生物活性蛋白運(yùn)輸至靶向細(xì)胞，從而介導(dǎo)骨微環(huán)境中細(xì)胞的交流，尤其是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。

CUI等[43]將礦化的前成骨細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面出現(xiàn)成骨標(biāo)志。通過(guò)上調(diào)Runx2、ALP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的礦化程度也能夠增加，因此得出外泌體介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的過(guò)程，參與機(jī)體骨重塑的機(jī)制中。同時(shí)他發(fā)現(xiàn)，MC3T3-E1細(xì)胞的外泌體能影響靶向細(xì)胞的miRNA，抑制Axin1表達(dá)和促進(jìn)β-連環(huán)蛋白表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)Wnt促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。XU等[44]也發(fā)現(xiàn)，C2C12肌母細(xì)胞來(lái)源的外泌體激活了Wnt/β-連環(huán)蛋白通路，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化。該特異性外泌體內(nèi)含有miRNA等物質(zhì)，其中的miR-27a-3p介導(dǎo)抗原呈遞 細(xì)胞的表達(dá)，成為促進(jìn)成骨的主要成分。QIN等[45]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體含有參與成骨的miR-196a、miR-27a、miR-206，通過(guò)信號(hào)呈遞介導(dǎo)骨細(xì)胞的分化，指出外泌體可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，刺激骨組織的再生，但通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)成骨細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯影響。

SUN等[46]發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞能夠分泌含有特異性miRNA的外泌體，其通過(guò)調(diào)節(jié)劑miR-214介導(dǎo)Runx和β-連環(huán)蛋白等通路，參與成骨細(xì)胞的分化過(guò)程。LI等[47]通過(guò)人體內(nèi)提取外泌體，在小鼠模型中進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)以及基因檢測(cè)，得出了類(lèi)似的結(jié)論，指出富含miR-214的外泌體不僅能夠抑制破骨細(xì)胞，也能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成。

4 外泌體在血管和骨骼肌中的作用

在骨折的同時(shí)通常會(huì)伴隨附近血管肌肉的損傷，骨折能否順利愈合與血管的重建再生相關(guān)。大量的研究報(bào)道指出血管和骨骼肌的再生與外泌體密切相關(guān)。BIAN等[48]將間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體用于急性心肌梗死大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠梗死的心肌血流顯著改善，梗死范圍明顯減少，表明外泌體在促血管生成活性中發(fā)揮重要作用。NAKAMURA等[49]發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體中富含miR-494，通過(guò)miRNA的表達(dá)，尤其是miR-494，參與促進(jìn)肌肉、血管的再生。CHOI等[50]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨骼肌成肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有多種信號(hào)分子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2等，通過(guò)早期與鄰近細(xì)胞融合，表現(xiàn)出類(lèi)似于肌小管一樣的表型，增加了肌球蛋白的表達(dá)。另外，他通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨骼肌成肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體也能夠增加肌纖維的數(shù)量，從而顯著增加骨骼肌的再生。

目前關(guān)于外泌體及其攜帶的miRNA如何介導(dǎo)血管肌肉損傷的修復(fù)的具體機(jī)制及信號(hào)通路尚不明確，同時(shí)筆者也檢索了國(guó)內(nèi)外多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)外泌體與骨骼肌損傷修復(fù)的報(bào)道較少，因此這可能能夠成為將來(lái)外泌體研究的一個(gè)方向，同時(shí)對(duì)血管骨骼肌損傷修復(fù)的治療也提供了一個(gè)新的突破口。

5 外泌體在軟骨再生中的作用

ZHANG等[26]通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)首次提出間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠參與骨軟骨的修補(bǔ)。在該研究中，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體加速了新組織填充，增強(qiáng) II型膠原基質(zhì)合成和硫酸化糖胺聚糖，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的軟骨成分完全恢復(fù)，與年齡匹配的對(duì)照組相類(lèi)似。然而在對(duì)照組中，僅僅發(fā)現(xiàn)纖維性修復(fù)，并無(wú)軟骨成分。外泌體包含多種成分，類(lèi)似miRNA、mRNAs、蛋白質(zhì)等，這些物質(zhì)極有可能參與細(xì)胞之間的通訊作用，從而發(fā)揮不同的功能，參與細(xì)胞內(nèi)不同的進(jìn)程。盡管參與軟骨修補(bǔ)特定的物質(zhì)未被找到，但是外泌體確實(shí)能夠發(fā)揮參與骨組織以及軟骨組織修復(fù)重建的作用。SUN等[51]發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，從高表達(dá)miR-320人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取的外泌體更能夠促進(jìn)關(guān)節(jié)骨軟骨細(xì)胞的增殖，下調(diào)MMP-19等，認(rèn)為這種特定的外泌體或許能成為一種新的治療方案。

6 展望

目前，盡管外泌體廣泛存在，通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)不難發(fā)現(xiàn)在一定條件下能夠參與促進(jìn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞生成，然而將外泌體作為一種治療方案，尚未見(jiàn)臨床研究報(bào)道，也沒(méi)有解決方案。相信在外泌體研究不斷深入的前提下，其在骨折愈合領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將更加廣闊。在體外可以通過(guò)細(xì)胞來(lái)源或者基因工程等方式大規(guī)模進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn)，從而更加廣泛地應(yīng)用于臨床。在促進(jìn)骨折愈合方面，外泌體可能是一種更加有效、方便、安全的治療方案。