長鏈非編碼RNA Linc00658在結直腸癌中的表達及其與西妥昔單抗抵抗的關系

張智勇，裘豐

（寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院東部院區(qū) 胃腸外科，浙江 寧波 315040）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率、病死率均較高的惡性腫瘤[1]。表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是上皮腫瘤中最重要的原癌基因之一，72%～89%的CRC組織中存在EGFR的高表達[2]。西妥昔單抗（Cetuximab）通過與EGFR內源性配體競爭性結合，阻斷下游酪氨酸激酶的激活，進而發(fā)揮抗腫瘤作用，是晚期CRC的一線治療藥物，但患者均易發(fā)生西妥昔單抗繼發(fā)性耐藥，找到發(fā)生耐藥的機制對 于臨床治療方案具有重要的指導意義。抑癌基因PTEN的丟失是導致CRC對西妥昔單抗耐藥的重要因素[3]，但其丟失的機制仍有待揭示。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）作為機體內廣泛表達的表觀調控因子，參與多種生物學過程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。本研究通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）Linc00658 可能通過micro RNA-19a-3p（miR-19a-3p）調控PTEN的表達，進而影響CRC細胞西妥昔單抗的敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人腎上皮細胞293T、人CRC細胞CaCo2（美國ATCC）。

1.1.2 試劑：Cetuximab（美國Selleck公司），DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基及FBS（美國Gibco公司），DMSO、雙抗及CCK-8試劑（美國Sigma-Aldrich公司），miRNA Control及miR-19a-3p mimic（上海漢恒生物公司），Linc00658過表達載體及Vector對照載體（上海吉凱基因公司），Lipofectamine 2000（美國Thermo Fisher公司），PTEN、磷酸化AKT（p-AKT）及磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（美國Cell Signaling Technology公司），TRIzoL及SuperScript IV反轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司），SYBR Green（美國MedChemExpress公司），Passive Lysis Buffer、Luciferase Assay Reaget、pGL3-basic Vector（美國Promega公司）。

1.1.3 儀器：iMark酶標儀、ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像儀（美國Bio-Rad公司），7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息網站預測以PTEN為靶基因的miRNA及其潛在結合的LncRNA：使用Targetscan數(shù)據(jù)庫及miRNA Cancer Association數(shù)據(jù)庫聯(lián)合預測與PTEN相互結合的miRNA，并采用LncBase v.2數(shù)據(jù)庫分析與靶miRNA相互作用的LncRNA。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及西妥昔單抗耐藥的誘導[6]：采用RPMI-1640培養(yǎng)基+10% FBS培養(yǎng)CaCo2細胞，培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃、5% CO2、飽和濕度。接種對數(shù)生長期的CaCo2細胞至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，傳代培養(yǎng)至4皿，隨機平均分為對照組及抵抗組。抵抗組采用4、8、16、32、64、128及256 nmol/L濃度梯度西妥昔單抗持續(xù)處理CaCo2細胞，每組濃度處理7 d，待細胞呈對數(shù)生長再使用更高濃度處理，直至細胞在 256 nmol/L西妥昔單抗中生長狀態(tài)良好；對照組采用等量的DMSO處理。

1.2.3 細胞轉染：接種1孔對照組及2孔抵抗組細胞于6孔細胞培養(yǎng)板中，以7.5 μL脂質體Lipofectamine 2000與2 μg Linc00658過表達載體混合于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入其中1孔抵抗組細胞中作為過表達組，另將15 μL脂質體與4 μg 對照載體混合于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，平均分為2份分別加入對照組及另1孔抵抗組細胞中。 6 h后PBS洗細胞3次后RPMI-1640+10% FBS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同樣利用Lipofectamine 2000在CaCo2細胞中轉染miR-19a-3p mimic及mimic NC作為本研究的mimic組及NC組。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞西妥昔單抗的半數(shù)抑制濃度（IC50）：接種對數(shù)生長期對照組、抵抗組、過表達組細胞、mimic組及NC組細胞于96孔板中，接種濃度為1×103/孔，每組細胞設置8個濃度梯度×5個重復樣本，12 h后更換含4、8、16、32、64、128、256及512 nmol/L西妥昔單抗的RPMI-1640+10% FBS處理48 h，10 μL CCK-8試劑加入待測樣本中，避光培養(yǎng)4 h，檢測450 nm吸光值，Graphpad Prism 8.0軟件繪制擬合曲線并估計每組細胞IC50值。

1.2.5 qRT-PCR檢測Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA表達：接種對數(shù)生長期的各組細胞于6孔板中，1 mL TRIzoL提取細胞總RNA，1 μg RNA進行反轉錄，其中miR-19a-3p RT-引物為特異性引物，序列為：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTG AGTCAGTTTT-3’，得到cDNA進行實時熒光定量PCR反應，引物如下：Linc00658上游（F）：5’-CGAGCAGCTCC ATCTACAGA-3’，下游（R）：5’-GCTGGGTGGTTCAAACTCA G-3’；miR-19a-3p上游（F）：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTG CAAATCTATGCAA-3’，下游（R）為通用引物；PTEN上游（F）：5’-GGACGAACTGGTGTAATGATATG-3’，下游（R）： 5’-TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC-3’；GAPDH上游（F）： 5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游（R）：5’-GTTGACTCC GACCTTCAC-3’。每組設置3個平行孔，GAPDH作為內 參，2（-△△CT）法計算各組細胞Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA相對表達水平。

1.2.6 Western blot檢測PTEN、p-AKT及p-mTOR蛋白表達：接種對數(shù)生長期的各組細胞于6孔板中，收集各組細胞總蛋白，以30 μg行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉至PVDF膜1.5 h，10%脫脂牛奶室溫孵育2 h，一抗4 ℃搖床孵育過夜，PBS洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育條帶1.5 h，PBS洗膜3次，每次10 min，ECL化學發(fā)光液孵育條帶，化學發(fā)

光成像系統(tǒng)對條帶印跡進行曝光顯影并拍照。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測Linc00658與miR-19a-3p的結合：將Linc00658構建至pGL3-basic載體上（長沙優(yōu)寶生物公司），DMEM+10% FBS培養(yǎng)293T細胞，接種至6孔板中并分為Negative control（NC）組及mimic組，NC組共轉染pGL3-basic-Linc00658及miRNA control，mimic組共轉染pGL3-basic-Linc00658及miR-19a-3p mimic，48 h后收集細胞懸液，預冷PBS洗細胞3次，100 μL PBL裂解液室溫孵育30 min，2組細胞各取10 μL上樣至96孔板中，每組設置5個平行孔，加入100 μL預混Luciferase Assay Reagent II檢測熒光強度為RLU1，加入100 μL 預混Stop & Glo Reagent檢測熒光強度為RLU2，以RLU1/RLU2作為各組相對熒光強度。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測Linc00658對miR-19a-3p介導的PTEN抑制的影響：將PTEN 3’UTR區(qū)構建至pGL3-basic載體上，接種293T細胞至6孔板中并分為PTEN+NC+Vector（PNV）組、PTEN+mimic+ Vector（PMiV）組及PTEN+mimic+Linco0658（PMi58）組，PNV組轉染pGL3-basic-PTEN、miRNA control及Vector；PMiV組轉染pGL3-basic-PTEN、miR-19a-3pmimic及Vector；PMi58組轉染pGL3-basic-PTEN、miR-19a-3p mimic及Linc00658過表達載體，方法同前。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件。正態(tài)分布計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 過表達Linc00658可部分逆轉CaCo2細胞對西妥昔單抗的耐藥 與對照組比，抵抗組及過表達組在4～512 nmol/L西妥昔單抗處理時，細胞存活率顯著增高（P＜0.01），通過曲線擬合法計算IC50，抵抗組及過表達組西妥昔單抗IC50均顯著增高（P＜0.01）；而相比抵抗組，過表達組在32～512 nmol/L 西妥昔單抗處理時，細胞存活率顯著降低（P＜0.01），通過曲線擬合法計算IC50，過表達組西妥昔單抗IC50顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 3組細胞在不同濃度西妥昔單抗下的細胞存活率

2.2 miR-19a-3p mimic可促進CaCo2細胞對西妥昔單抗的抵抗 與NC組比，mimic組在8～512 nmol/L 西妥昔單抗處理時，細胞存活率顯著增高（P＜0.01），通過曲線擬合法計算IC50，mimic組西妥昔單抗IC50顯著增高（P＜0.01），見圖2。

2.3 過表達Linc00658可抑制miR-19a-3p并上調PTEN mRNA的表達 qRT-PCR結果顯示，相比對照組，抵抗組Linc00658及PTEN mRNA表達顯著降低，miR-19a-3p表達顯著增高（P＜0.01）；相比抵抗組，過表達組Linc00658及PTEN mRNA表達顯著增高，miR-19a-3p表達顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖2 NC及mimic組細胞在不同濃度西妥昔單抗下的細胞存活率

圖3 各組細胞Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA相對表達量

2.4 過表達Linc00658可上調PTEN并抑制p-AKT及p-mTOR的蛋白表達 Western blot結果顯示，與對照組比，抵抗組PTEN表達顯著降低，p-AKT及p-mTOR蛋白表達顯著增高（P＜0.05）；相比抵抗組，過表達組PTEN表達顯著增高，p-AKT及p-mTOR蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細胞PTEN、p-AKT及p-mTOR的Western blot結果

2.5 miR-19a-3p可抑制Linc00658熒光素酶活性 LncBase數(shù)據(jù)庫分析與miR-19a-3p具有潛在結合的LncRNA，結果顯示miR-19a-3p與Linc00658轉錄本48～65位點以8mer的形式結合（見圖5A），同時，相比NC組，mimic組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），見圖5B。

2.6 Linc00658對PTEN熒光素酶活性的影響 TargetScan及miRcancer數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析與PTEN相互作用miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p與PTEN 3’UTR區(qū)411-417位點以7mer-m8的形式結合（見圖6A），相比PNV組，PMiV組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01）；相比PMiV組，PMi58組熒光素酶活性顯著增高（P＜0.01），見圖6B。

3 討論

ncRNA作為分布廣泛的表觀遺傳調控因子，參與機體絕大多數(shù)生物學過程。西妥昔單抗耐藥的發(fā)生同樣存在ncRNA的異常表達及調控，LU等[7]及THOMAS等[8]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA miR100HG可協(xié)同miR-100和miR-125b介導Wnt/β-catenin通路的激活，進而促進CRC及頭頸鱗癌細胞西妥昔單抗耐藥；JING 等[9]及PENG等[10]發(fā)現(xiàn)LncRNA Linc00973可通過調控糖代謝促進西妥昔單抗耐藥細胞株的惡性表型。另外，miR-204、miR-143、miR-145及miR-146a等均被發(fā)現(xiàn)通過不同途徑參與影響腫瘤細胞西妥昔單抗耐 藥[11-13]。

miR-19a-3p作為PTEN的上游負性調控因子，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用，包括骨肉瘤、胃癌、肝細胞癌及乳腺癌等[14-17]，其中，LI等[15]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA SLC25A5-AS1可作為miR-19a-3p的內源競爭性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），抑制其介導的PTEN丟失及胃癌細胞的惡性表型；miR-19a-3p在結直腸癌中同樣也被發(fā)現(xiàn)可通過抑制FOXF2 mRNA水平，進而促進細胞上皮-間充質轉化、侵襲、遷移和增殖能力[18]。考慮到PTEN的丟失是腫瘤細胞西妥昔單抗耐藥的重要原因之一[19-20]， 同時，基于LncRNA與西妥昔單抗耐藥的廣泛聯(lián)系，本研究首先通過生物信息技術在CRC細胞中預測到與miR-19a-3p潛在結合的LncRNA Linc00658，并觀察到Linc00658及miR-19a-3p在西妥昔單抗抵抗的CRC細胞株中異常表達，提示兩者可能存在相互作用并參與調控PTEN進而影響CRC細胞西妥昔單抗抵抗的形成。故我們在抵抗細胞中外源性過表達Linc00658，發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p表達顯著降低，而PTEN mRNA及蛋白表達均顯著增高，其靶分子AKT及mTOR顯著激活，同時抵抗細胞西妥昔單抗敏感性增高，表明Linc00658可能作為miR-19a-3p的ceRNA發(fā)揮表觀調控作用，間接影響PTEN的表達，進而影響CRC細胞西妥昔單抗敏感性。進一步我們通過熒光素酶報告基因驗證了Linc00658與miR-19a-3p存在顯著結合，表明Linc00658同SLC25A5-AS1一樣[15]，可作為miR-19a-3p的ceRNA發(fā)揮調控PTEN的作用。綜上，Linc00658通過競爭性結合miR-19a-3p，促進CRC細胞PTEN的表達及西妥昔單抗的敏感性。我們將進一步通過構建突變體及體內實驗證實上述推論，為相關藥物靶點及標志物的開發(fā)提供依據(jù)。

圖5 miR-19a-3p對Linc00658熒光素酶活性的影響

圖6 Linc00658對PTEN熒光素酶活性的影響