桂花渣粕黃酮提取物的制備及酶法修飾

房仙穎，周江蓮，王靖秋，湯鋒，趙林果*

(1.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210037；2.國際竹藤中心，北京 100102)

桂花 (Osmanthusfragrans)是我國傳統(tǒng)的名花，兼具觀賞性、食用性、生態(tài)、社會和經(jīng)濟效應(yīng)。根據(jù)桂花開花季節(jié)的不同，分為四季桂和秋桂兩類；根據(jù)桂花花色的不同，分為金桂、丹桂和銀桂3個品種群[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為桂花入藥可活血化瘀、補脾益腎，用于治療胃痛、扭傷、牙痛以及風(fēng)濕麻木等病癥。然而，目前桂花的開發(fā)主要集中在浸膏、精油的提取和食材應(yīng)用(桂花茶、桂花酒等)上。由于桂花浸膏和桂花精油的提取率極低[2]，如果將桂花浸膏/精油提取后的桂花渣粕拋棄將造成桂花資源的浪費。另一方面，桂花中含有黃酮類化合物、酚類化合物、葉綠素、綠原酸、毛蕊花糖苷等非揮發(fā)性成分，這些成分均具有廣泛的生物活性[3]，特別是黃酮類化合物[4]。然而，關(guān)于桂花黃酮類化合物的應(yīng)用研究非常少，也未見相關(guān)產(chǎn)品，原因可能與桂花提取物的活性成分研究不夠細致或粗提物活性不高有關(guān)[5]。因此，這些活性物質(zhì)是否殘留在提取渣中、如何進一步提高黃酮類化合物的生物活性都是值得深入研究的課題。

天然黃酮多以糖苷形式存在，桂花黃酮亦是如此，包括蘆丁、柚皮苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等[6]。Xiao等[7]研究表明，O-糖基化數(shù)目的減少能增強黃酮抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗菌和抗腫瘤等活性。如果通過糖苷酶對桂花黃酮進行催化，有望增強其生物活性，進而提高應(yīng)用價值[8]。通過分析桂花黃酮主要成分的種類及結(jié)構(gòu)可知，其糖苷主要有葡萄糖苷，以及少量的鼠李糖苷[6]。利用優(yōu)良的β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶可以選擇性切斷其中O-糖苷上的糖基[9]。

筆者以桂花及其渣粕為原料，用乙醇熱回流法提取并用蘆丁法檢測其中的桂花黃酮含量；通過生物酶催化，比較催化前后桂花黃酮的生物活性。研究結(jié)果可為桂花資源的綜合高效利用提供新思路，為制備生物活性更強的桂花黃酮提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

桂花采摘于南京林業(yè)大學(xué)校園，品種由南京林業(yè)大學(xué)桂花登錄中心鑒定，分別為金桂、銀桂、丹桂和四季桂；蘆丁、毛蕊花糖苷標準品購于上海阿拉丁試劑有限公司；大孔樹脂HPD400購于南京姜華化玻有限公司；Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)、 Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購于美國Hyclone公司；對硝基苯酚-β-D-葡萄糖、對硝基苯酚-α-L-鼠李糖苷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和二甲亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司；胰酶消化液、NO檢測試劑盒、噻唑藍(MTT)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Cell signaling technology(CST)抗體cleaved-Caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)3, 6, 7, 9、cleaved-PARP和GAPDH購于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑均購于南京化學(xué)試劑有限公司。

小鼠RAW264.7巨噬細胞、人HepG2肝癌細胞和小鼠CT26結(jié)腸癌細胞均購自中國科學(xué)院細胞庫。細胞的培養(yǎng)條件為RPMI-1640完全培養(yǎng)基(添加質(zhì)量分數(shù)10%FBS)，37 ℃，5%CO2；HepG2和CT26細胞的培養(yǎng)條件為DMEM完全培養(yǎng)基(添加質(zhì)量分數(shù)10%FBS)，37 ℃，5%CO2。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SpectraMax190型酶標儀，美國Molecular Devices公司；1260型HPLC，美國Agilent公司；SJIA-10N-50A 型小型臺式冷凍干燥機，寧波市雙嘉儀器有限公司；RV 05 Basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；超凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；垂直平板電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光成像儀，美國Gene公司。

1.3 桂花黃酮的提取及含量測定

將新鮮桂花洗凈于60 ℃下干燥48 h，至含水率<5%。以干燥花朵或桂花渣粕為原料，采用乙醇回流提取法提取活性成分。提取工藝為80%(體積分數(shù))乙醇溶液， 料液比1∶50(g∶mL)，70 ℃回流提取3次，每次2 h，合并濾液，用80%乙醇溶液定容至600 mL。取5 μL提取液，按照蘆丁法[3]測定總黃酮含量。

1.4 桂花渣粕制備

取干燥桂花粉末適量，加入5倍于粉末質(zhì)量的蒸餾水，連接揮發(fā)油提取裝置，采用水蒸氣蒸餾法提取桂花精油[10]，回流提取5～6 h，收集揮發(fā)油。將燒瓶中的桂花-水混懸液進行減壓濃縮并干燥，得到桂花渣粕。

1.5 桂花黃酮的HPLC檢測條件

色譜柱為XDB-C18柱[4.6 mm×250 mm(直徑×長度), 填料顆粒直徑5 μm]；柱溫40 ℃；流動相為甲醇(A)和質(zhì)量分數(shù)0.1%甲酸溶液(B)：0～30 min內(nèi)VA∶VB從50∶50升至80∶20， 30～37 min內(nèi)VA∶VB從80∶20降至50∶50；檢測波長為280，320和360 nm；進樣量為10 μL；流速為0.8 mL/min。

1.6 桂花黃酮的純化

對桂花黃酮提取液進行減壓濃縮，得到水濃縮液。濃縮液經(jīng)HPD400大孔樹脂柱純化，依次用3倍柱體積的水、20%(體積分數(shù))乙醇和80%(體積分數(shù))乙醇洗脫，收集80%洗脫部分，減壓濃縮除去乙醇后，冷凍干燥，備用。

1.7 糖苷酶的制備

β-葡萄糖苷酶由重組大腸桿菌pET-20b-Tpebgl3高效表達獲得，Tpebgl3基因來源于嗜熱菌ThermotogapetrophilaRKU-1。α-L-鼠李糖苷酶由重組酵母菌pPICZαA-AtRha高效表達獲得，AtRha基因來源于AspergillusterreusCCF 3059。上述兩種基因重組菌均為南京林業(yè)大學(xué)微生物技術(shù)研究室研發(fā)，酶制劑制備及酶活力測定參照文獻[11-13]。

1.8 桂花總黃酮的酶法催化

對照組：向1 000 μL反應(yīng)體系中加入100 μL 100 mg/mL 的桂花黃酮儲備液，900 μL純水，再加入1 000 μL甲醇。酸水解組：向1 000 μL反應(yīng)體系中加入100 μL 100 mg/mL的桂花總黃酮儲備液，900 μL酸水解液(甲醇和質(zhì)量分數(shù)25%HCl，體積比為 4∶1)，80 ℃反應(yīng)2 h后，冷卻反應(yīng)液，再加入1 000 μL甲醇。

β-葡萄糖苷酶(BG)/α-L-鼠李糖苷酶(Rha)催化：向1 000 μL反應(yīng)體系中加入100 μL 100 mg/mL的桂花總黃酮儲備液，加入90 U BG 或者25 U Rha，最后補加去離子水至1 000 μL。BG組于90 ℃反應(yīng)1 h，Rha組于65 ℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束冷卻反應(yīng)液，加入1 000 μL甲醇終止反應(yīng)。

雙酶聯(lián)用Rha-BG：向1 000 μL反應(yīng)體系中加入100 μL 100 mg/mL的桂花總黃酮儲備液，加入25 U Rha，65 ℃反應(yīng)1 h，隨后加入90 U BG，待90 ℃反應(yīng)1 h，加入去離子水使反應(yīng)體系為1 000 μL。冷卻反應(yīng)液，加入1 000 μL甲醇終止反應(yīng)。

雙酶聯(lián)用BG-Rha：同上，改變加酶順序。

將酶解前和單獨使用酸水解液、Rha和BG催化、雙酶聯(lián)用催化后的樣品分別進行HPLC分析。

向上述水解體系中加入過量乙醇，待酶沉淀后過濾除去，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓干燥，制成粉末，用DMSO配成100 mg/mL的儲備液，用于生物活性的評價實驗。

1.9 Griess法測定抗炎活性

按照NO檢測試劑盒(Griess法)說明進行：取對數(shù)期的RAW264.7細胞，計數(shù)，以2×105個/mL 的密度接種于96孔板中，每孔100 μL；培養(yǎng)24 h后，以不同質(zhì)量濃度的化合物(1，10和100 μg/mL，每孔50 μL)及500 ng/mL 脂多糖(LPS，每孔50 μL)處理細胞。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，以含DMSO的培養(yǎng)液作對照?；衔镒饔?8 h后，吸取細胞上清100 μL至酶標板中，加入混勻后的Griess試劑100 μL，顯色10 min后540 nm處測吸光度。統(tǒng)計數(shù)據(jù)為3次獨立實驗結(jié)果的平均值±誤差值。

1.10 DPPH自由基清除試驗

根據(jù)文獻[14]中的方法，將樣品用甲醇配制成一系列質(zhì)量濃度，取100 μL樣品(100，300和900 μg/mL)加入100 μL DPPH溶液(0.15 mg/mL，純甲醇為溶劑)，混勻，避光放置30 min后測定514 nm處吸光度。每份樣品平行操作3 次，統(tǒng)計數(shù)據(jù)為3次獨立實驗結(jié)果的平均值±誤差值。計算公式如下:

清除率=[(AC-AS)/AC]×100%

(1)

式中：AC為0.1 mL DPPH溶液與0.1 mL甲醇混合后的吸光度；AS為0.1 mL DPPH溶液與0.1 mL樣品混合后的吸光度。

1.11 MTT法測定抗腫瘤活性

以臺盼藍染色計數(shù)后，在96孔板中每孔接種3×103個細胞100 μL，待細胞貼壁后，每孔加入不同質(zhì)量濃度化合物(1，10和100 μg/mL，每孔100 μL)共培養(yǎng)，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)72 h。終止培養(yǎng)前4 h加入20 μL MTT(4 mg/mL)培養(yǎng)基溶液。4 h后吸去上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩，使沉淀完全溶解，540 nm處測吸光度，并記錄讀數(shù)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)為3次獨立實驗結(jié)果的平均值±誤差值。

1.12 流式細胞儀檢測細胞凋亡

在6孔板中按每孔5×105個HepG2細胞種板，待細胞貼壁后加入指定濃度的化合物，培養(yǎng)24 h后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗一遍，消化、收集細胞。取(5～10)×104個細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，先加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。接著加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，混勻，室溫下避光孵育10～20 min，置于冰浴中，隨即用流式細胞檢測儀檢測。

1.13 免疫印跡分析(Western Blotting，WB)

收集經(jīng)不同質(zhì)量濃度化合物處理后的HepG2細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌一次，細胞計數(shù)。各取1×106個細胞，加入150 μL的蛋白裂解液得到總細胞蛋白，用BCA法定量。以50 μg的蛋白量上樣，聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。按抗體說明書孵育一抗和二抗，增強化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色并于化學(xué)發(fā)光成像儀中拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花原料及桂花渣粕中總黃酮含量的測定

分別以金桂、銀桂、丹桂和四季桂的花瓣為原料，用熱回流提取法提取并計算桂花中的總黃酮含量。結(jié)果表明，金桂的總黃酮含量最高，約為42.6%，且4種桂花中的總黃酮含量差異不大。采用水蒸氣蒸餾法提取金桂中的桂花精油，收集桂花渣粕，采用熱回流提取法對桂花渣總黃酮進行提取，測定其總黃酮含量約為38.6%，較原料花瓣中總黃酮僅有少量損失。此外，用HPLC法對桂花黃酮提取物中的毛蕊花糖苷含量進行測定，結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷在桂花渣粕中的含量約為5.50%。毛蕊花糖苷屬于苯丙素苷類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、促進傷口愈合、神經(jīng)保護等生物活性[15]。研究結(jié)果表明桂花提取渣是一種值得精深加工的寶貴資源。

2.2 桂花黃酮的純化及酶法催化

由于天然產(chǎn)物的醇提物中除了黃酮類物質(zhì)，還有大量的多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)[16]。因此，用中極性的HPD400大孔樹脂對桂花黃酮進行了純化，除去多糖、蛋白等成分。天然黃酮多以糖苷形式存在，有研究表明，糖基數(shù)量的減少有利于抗炎、氧化、抗腫瘤等活性的提升。因此，采用Rha和/或BG對桂花黃酮進行酶解處理，結(jié)果如圖1所示。桂花渣粕黃酮提取物經(jīng)BG催化后，在HPLC特征圖譜的11.667，16.153，17.498，18.022，19.512和23.104 min位置出現(xiàn)峰面積的大幅增加，在10 min內(nèi)出現(xiàn)的峰則發(fā)生了顯著的峰面積減少，說明該酶僅能特異性地切掉糖苷物質(zhì)末端的葡萄糖。前期研究結(jié)果顯示，桂花黃酮糖苷在該檢測條件下出峰時間在10 min之前，而苷元在9 min后，由此說明有一部分桂花黃酮可能被β-葡萄糖苷酶水解為苷元了，而Rha催化前后的圖譜變化較小，表明桂花黃酮糖苷的末端幾乎沒有可被Rha切斷的鼠李糖。BG和雙酶聯(lián)合催化的結(jié)果相似，并且雙酶聯(lián)合催化的加酶順序?qū)Υ呋Y(jié)果影響較小，說明桂花黃酮苷中末端或者次末端為葡萄糖基的較多，幾乎沒有鼠李糖基。

此外，通過與酸水解組的結(jié)果比較可知，糖苷酶水解具有專一性，僅會切斷黃酮母核上連接的糖苷鍵，不會破壞黃酮母核；而酸水解無選擇性，可以切斷所有糖苷鍵甚至?xí)茐狞S酮的母核結(jié)構(gòu)。毛蕊花糖苷的糖基分子不在末端，實驗結(jié)果表明這2個糖苷酶不會改變其結(jié)構(gòu)(圖1)。因此，桂花渣粕黃酮提取物經(jīng)Rha和BG催化后，總黃酮和毛蕊花糖苷的含量不會改變，說明利用生物酶水解黃酮糖苷具有明顯優(yōu)勢。

圖1 桂花黃酮酶法催化前后的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of Osmanthus flavonoids before and after enzymatic conversion

2.3 桂花黃酮酶法催化前后抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性比較

用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細胞建立細胞炎癥模型，通過Griess試劑顯色法檢測RAW 264.7細胞NO的釋放量，其抗炎活性結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，桂花黃酮對照組在低濃度下幾乎沒有抗炎活性；在10 μg/mL時，經(jīng)BG催化和BG-Rha雙酶催化后抗炎活性較對照組顯著提高；在高濃度下，酶催化后樣品的抗炎活性顯著高于對照組，抑制率均達95%以上。由IC50值可看出，要達到50%抗炎抑制率，經(jīng)BG催化后的桂花黃酮所需要的質(zhì)量濃度最低，為8.26 μg/mL。

圖2 桂花黃酮酶法催化前后對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞釋放NO的抑制作用Fig. 2 Inhibition on LPS-induced NO production of RAW 264.7 cells by Osmanthus flavonoids before and after enzymatic conversion

桂花黃酮酶法催化前后對DPPH自由基清除作用的結(jié)果如圖3所示，5組樣品在低濃度時對DPPH自由基的清除能力都比較弱，隨著濃度的升高，清除DPPH自由基能力均逐漸增強，其中經(jīng)酶處理后的樣品的抗氧化活性明顯高于未經(jīng)處理的對照組樣品。經(jīng)BG處理后樣品的抗氧化活性最高，達到50%清除率(IC50)所需的質(zhì)量濃度最低，為493.44 μg/mL。

圖3 桂花黃酮酶法催化前后對DPPH自由基的清除作用Fig. 3 DPPH radical-scavenging activity of Osmanthus flavonoids before and after enzymatic conversion

圖4 桂花黃酮酶法催化前后抗腫瘤活性Fig. 4 Antitumor activity of ethanol extract from Osmanthus flavonoids before and after enzymatic conversion

酶法催化前后桂花黃酮對人肝癌HepG2細胞和小鼠結(jié)腸癌CT26細胞體外增殖的影響如圖4所示。在高濃度下，酶法催化可顯著提高桂花黃酮的抗腫瘤活性。BG處理后的桂花黃酮對HepG2細胞增殖的抑制率可高達85%，IC50值為51.32 μg/mL；對CT26細胞增值的抑制率可達到80%，IC50值為55.81 μg/mL。由此可知，單獨使用BG催化對桂花黃酮抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性的提高作用最強。根據(jù)HPLC圖譜的分析，有一部分桂花黃酮可能被BG水解為苷元，黃酮母核上連接的糖基數(shù)的減少有利于增加上述3種活性。雙酶聯(lián)用雖然同樣能減少黃酮母核上連接的糖基數(shù)，但部分結(jié)構(gòu)的改變未能體現(xiàn)在HPLC圖譜上，需要借助分辨度更高的檢測方法才能分析出差異；Rha催化對桂花黃酮組成的影響則相對較小。因此，綜合考慮酶法催化前后桂花黃酮的HPLC檢測圖譜變化情況、活性變化情況以及生產(chǎn)成本，比較適宜的方案是單獨使用β-葡萄糖苷酶對桂花黃酮進行催化。通常對體內(nèi)炎癥的抑制和氧化水平的控制有助于腫瘤的治療[17]，酶法催化后的桂花黃酮對人源HepG2細胞的IC50值比對小鼠源的CT26細胞還低，說明桂花黃酮在防治肝癌方面有一定的開發(fā)價值。

2.4 桂花黃酮對HepG2肝癌細胞凋亡的影響

凋亡是清除腫瘤細胞的主要途徑，不會給正常的細胞或周邊組織帶來過度損傷[18]。以BG催化后的桂花黃酮為原料，考察其抑制HepG2細胞增殖的作用機制。細胞凋亡早期的特征之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，用FITC-Annexin V可檢測暴露在細胞膜表面的PS；PI可以穿透凋亡晚期和死細胞的破損細胞膜，嵌入雙鏈DNA并使細胞核染紅。利用流式細胞儀檢測Annexin V/PI雙染的細胞可以觀察細胞凋亡情況，并區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡/壞死的細胞，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，桂花總黃酮能夠誘導(dǎo)HepG2細胞的凋亡，在100 μg/mL的質(zhì)量濃度下細胞早期凋亡率為14.90%，總凋亡率為23.88%。

圖5 β-葡萄糖苷酶催化后的桂花黃酮對HepG2細胞凋亡的影響Fig. 5 Effects of Osmanthus flavonoids transformed by β-glucosidase on apoptosis of HepG2 cells

圖6 桂花黃酮對細胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達的影響Fig. 6 Effects of Osmanthus flavonoids on the expression of related proteins in cell apoptotic pathway

Caspase家族蛋白的活化是凋亡中的關(guān)鍵步驟，哺乳動物細胞凋亡主要分為2個途徑：一是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路，發(fā)生Caspase 9的剪切；另一個是死亡受體介導(dǎo)的外源性通路，發(fā)生Caspase 8的剪切[19]。筆者通過WB實驗檢測了桂花黃酮對凋亡通路相關(guān)的級聯(lián)剪切蛋白表達量的影響，結(jié)果如圖6所示。桂花黃酮在100 μg/mL的質(zhì)量濃度下可以導(dǎo)致Caspase 9的剪切，進而導(dǎo)致Caspase 7和Caspase 3的剪切，最終促進多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的剪切。結(jié)果表明，桂花黃酮可能通過線粒體途徑促進HepG2細胞的凋亡。

3 結(jié) 論

1)金桂花瓣以水蒸氣蒸餾法提取精油后，桂花渣中的總黃酮含量還高達38.7%，與未提取精油前相比損失未超過5%，并且桂花渣中毛蕊花糖苷的含量為5.5%，故提取渣具有很好的開發(fā)價值。

2)利用β-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和雙酶聯(lián)用對純化后的桂花黃酮進行催化，桂花黃酮有相當(dāng)一部分以糖苷形式存在，其末端多為葡萄糖基，但末端為鼠李糖基的糖苷存在很少。

3)酶法催化后桂花黃酮的抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性均得到了不同程度的提高。其中，經(jīng)β-葡萄糖苷酶催化得到的桂花黃酮活性最好，對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥模型的IC50值由34.55 μg/mL 下降到8.26 μg/mL；對DPPH自由基清除作用的IC50值由大于900.00 μg/mL下降到493.44 μg/mL；對人肝癌HepG2細胞增殖的IC50值由大于100.00 μg/mL降至51.32 μg/mL；對小鼠結(jié)腸癌CT26細胞增殖的IC50值由大于100.00 μg/mL降至55.81 μg/mL。

4) 抑制體內(nèi)炎癥和降低細胞氧化水平有助于腫瘤的治療，而桂花黃酮對人肝癌HepG2細胞體外增殖表現(xiàn)出顯著的抑制作用，提示桂花黃酮在防治肝癌方面具有一定的開發(fā)價值。通過流式細胞儀Annexin V/PI雙染檢測發(fā)現(xiàn)，桂花黃酮能夠在早期誘導(dǎo)HepG2細胞的凋亡，并且可能是通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)的。

綜上所述，桂花提取精油后的渣不應(yīng)直接作為廢棄物處理，值得對桂花渣中的活性物質(zhì)深入開發(fā)，實現(xiàn)桂花資源的綜合高效利用。