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    刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮病小鼠Wnt3a/β-catenin表達(dá)的影響*

    2020-11-28 08:19:30盧軍何承輝阿依提拉麥麥提江康小龍
    關(guān)鍵詞:系統(tǒng)性小鼠劑量

    盧軍,何承輝,阿依提拉·麥麥提江,康小龍

    (1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 藥物研究室,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所 藥劑室,新疆 烏魯木齊 830004)

    系統(tǒng)性硬皮病的病理表現(xiàn)為多組織、多器官纖維化,免疫系統(tǒng)失衡及血管異常[1]。刺山柑為白花菜科山柑屬植物,系新疆道地藥材。刺山柑果實乙醇提取物對成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原的合成有一定抑制作用[2]。硬皮病模型小鼠的膠原沉積、真皮增厚等病理改變可被刺山柑流浸膏抑制[3]。給硬皮病小鼠外用刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取物后,小鼠真皮增厚,Ⅰ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子-β1過表達(dá)被抑制[4]。刺山柑總生物堿系本課題組從刺山柑中提取的有效成分,前期研究表明,將刺山柑總生物堿制成乳膏給系統(tǒng)性硬皮病小鼠外用后,小鼠皮膚增厚、纖維化等情況有所改善[5],同時羥脯氨酸及Ⅰ、Ⅲ型膠原過表達(dá)被逆轉(zhuǎn)[6-7],提示刺山柑總生物堿可抑制系統(tǒng)性硬皮病膠原合成,改善組織纖維化。本實驗觀察刺山柑總生物堿對Wnt 通路相關(guān)蛋白Wnt3a、Wnt1 誘導(dǎo)的信號通路蛋白1(WISP1)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的影響,研究其對系統(tǒng)性硬皮病Wnt/β-catenin 通路的調(diào)控作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    雌性BALB/c 小鼠90 只,體重18 ~22 g,購自北京維通利華實驗動物公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。

    1.2 實驗藥物

    刺山柑原藥材(新疆麥迪森維藥飲片廠),刺山柑乳膏(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥物研究室自制)鹽酸博萊霉素注射劑(批號:17001711,上海瀚暉制藥有限公司),青霉胺片(批號:052160901,上海上藥信誼藥廠)。

    1.3 試劑

    β-catenin 抗體、goat anti-rabbit IgG-HRP 購自美國Cell Signaling 公司,SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒、小鼠WISP1 ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,高純總RNA 快速提取試劑盒、SYBR real-time PCR 試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司,小鼠Wnt3a ELISA 試劑盒購自武漢華美生物公司,蛋白測定試劑盒(BCA 法)購自江蘇碧云天生物公司。

    1.4 儀器

    酶標(biāo)儀(型號:Multiskan Spectrum)、低溫離心機(型號:Multifuge X1R)購自美國Thermo Fisher 公司,顯微鏡(型號:LEICA DFC360 FX)、切片機(型號:LEICA RM2245)購自德國Leica 公司,實時定量PCR 儀(型號:C1000 Thermal Cycler)購自美國Bio-Rad 公司。

    1.5 方法

    1.5.1 小鼠系統(tǒng)性硬皮病模型的復(fù)制及給藥方法BALB/c 小鼠90 只隨機分為6 組:空白對照組、系統(tǒng)性硬皮病模型組(SSc 模型組)、刺山柑總生物堿低劑量組(225 mg/kg)、刺山柑總生物堿中劑量組(450 mg/kg)、刺山柑總生物堿高劑量組(900 mg/kg)及青霉胺組(125 mg/kg),每組15 只。剃除小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛,除空白對照組背部皮下注射生理鹽水外,其余各組皮下注射鹽酸博萊霉素復(fù)制系統(tǒng)性硬皮病模型[8-9]:30 μg/d×30 d,然后各給藥組小鼠背部外敷刺山柑乳膏,青霉胺組小鼠給予青霉胺灌胃,1 次/d×60 d。

    1.5.2 小鼠皮膚組織Wnt3a 和WISP1 濃度的檢測未次給藥4 h 后處死小鼠,取小鼠背部皮膚用組織勻漿機研磨成10%組織勻漿,離心(4 000 r/min,10 min),ELISA 試劑盒測定上清液中Wnt3a 和WISP1 的濃度,ELISA 結(jié)果用上清液中總蛋白濃度(BCA 蛋白定量試劑盒檢測)進(jìn)行校正。

    1.5.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 表達(dá)未次給藥4 h 后處死小鼠,取小鼠背部皮膚,液氮迅速冷凍10 min,置入-80℃冰箱冷凍保存。采用高純總RNA 快速提取試劑盒(離心柱型)提取組織總RNA,操作按試劑盒說明書進(jìn)行,逆轉(zhuǎn)錄獲到cDNA,設(shè)計特異性β-catenin 引物,β-catenin 正向引物為5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3',反向引物為5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3';內(nèi)參照Rn18s 正向引物為5'-CTATTTTGGTTTTCGGAACTGAG-3',反向引物為5'-TTGGCAAATGCTTTCGCTCTG-3'。采用2-△△Ct法計算mRNA 相對表達(dá),即相對表達(dá)量=2-△△Ct,△Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因,△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。

    1.5.4 免疫組織化學(xué)法檢測小鼠皮膚組織β-catenin蛋白表達(dá)未次給藥4 h 后處死小鼠,取小鼠背部注射區(qū)皮膚,4%多聚甲醛中固定、脫水、包埋、切片。脫蠟,放入檸檬酸鈉液中,微波修復(fù)5 min,用3%H2O2封閉20 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,β-catenin一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,DAB 染色后用蘇木精復(fù)染。顯微鏡攝片后輸入計算機,Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件對圖片進(jìn)行分析,求得積分光密度與組織面積的比值即平均光密度,各組平均光密度與空白對照組平均光密度的比值作為β-catenin的相對表達(dá)量。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Wnt3a 和WISP1 濃度的比較

    各組小鼠皮膚組織Wnt3a 和WISP1 濃度比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SSc 模型組Wnt3a和WISP1 較空白對照組升高(P<0.05);刺山柑總生物堿中劑量組Wnt3a 較SSc 模型組降低(P<0.05);刺山柑總生物堿各劑量組、青霉胺組WISP-1與SSc 模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    2.2 β-catenin mRNA 相對表達(dá)量比較

    各組小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 相對表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SSc 模型組較空白對照組升高(P<0.05),刺山柑總生物堿中劑量組、高劑量組及青霉胺組較SSc 模型組降低(P<0.05);刺山柑總生物堿中劑量組、高劑量組與青霉胺組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖1。

    表1 各組小鼠皮膚組織Wnt3a 和WISP1 濃度比較(n =15,±s)

    注:①與空白對照組比較,P <0.05;②與SSc 模型組比較,P <0.05。

    組別 Wnt3a/(pg/mg) WISP1/(ng/mg)空白對照組 182.79±47.05 1.32±0.36 SSc 模型組 293.17±59.66① 2.02±0.40①刺山柑總生物堿低劑量組 300.73±46.77 1.93±0.32刺山柑總生物堿中劑量組 245.77±56.09② 1.89±0.35刺山柑總生物堿高劑量組 269.84±44.64 2.11±0.44青霉胺組 274.84±39.48 2.00±0.50 F 值 11.336 7.499 P 值 0.000 0.000

    2.3 β-catenin 蛋白相對表達(dá)量比較

    免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果顯示,各組小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白相對表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SSc 模型組較空白對照組升高(P<0.05);刺山柑總生物堿各劑量組及青霉胺組較SSc 模型組降低(P<0.05);刺山柑總生物堿各劑量組與青霉胺組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3和圖2、3。

    表2 各組小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 相對表達(dá)量比較 (n =15,±s)

    表2 各組小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 相對表達(dá)量比較 (n =15,±s)

    注:①與空白對照組比較,P <0.05;②與SSc 模型組比較,P <0.05。

    組別 β-catenin mRNA 相對表達(dá)量空白對照組 1.00±0.00 SSc 模型組 2.50±0.39①刺山柑總生物堿低劑量組 2.30±0.40刺山柑總生物堿中劑量組 1.71±0.46②刺山柑總生物堿高劑量組 1.81±0.46②青霉胺組 1.37±0.39②F 值 10.620 P 值 0.000

    圖1 小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 相對表達(dá)量比較(±s)

    表3 各組小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白相對表達(dá)量比較(n =15,±s)

    表3 各組小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白相對表達(dá)量比較(n =15,±s)

    注:①與空白對照組比較,P <0.05;②與SSc 模型組比較,P <0.05。

    組別 β-catenin 蛋白相對表達(dá)量空白對照組 1.00±0.00 SSc 模型組 5.66±1.82①刺山柑總生物堿低劑量組 2.71±0.98②刺山柑總生物堿中劑量組 3.69±1.70②刺山柑總生物堿高劑量組 2.47±0.95②青霉胺組 2.91±1.50②F 值 5.524 P 值 0.003

    圖2 小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

    圖3 小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白表達(dá)情況 (免疫組織化學(xué)×100)

    3 討論

    系統(tǒng)性硬皮病呈現(xiàn)多組織、多器官進(jìn)行性纖維化,其病因與成纖維細(xì)胞異常增殖,膠原、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過度合成并沉積有關(guān)[10-11]。Wnt/β-catenin 信號通路是成纖維細(xì)胞持續(xù)活化的關(guān)鍵途徑之一,在肺、皮膚等器官纖維化進(jìn)程中起重要作用[12]。研究表明,在系統(tǒng)性硬皮病皮膚和肺組織成纖維細(xì)胞中Wnt/β-catenin 通路被激活,β-catenin 水平升高,導(dǎo)致系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞中β-catenin 蓄積,細(xì)胞核內(nèi)β-catenin 水平升高使目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄增加,引起系統(tǒng)性硬皮病組織纖維化[13-15]。Wnt3a 是Wnt 通路中的重要配體,WEI 等[16]和BAYLE 等[17]研究表明,Wnt3a/β-catenin 通路過度激活,可引起系統(tǒng)性硬皮病患者皮膚成纖維細(xì)胞增殖,ECM 合成增加,異常增多的Wnt3a 與受體結(jié)合激活β-catenin 可引發(fā)系統(tǒng)性硬皮病組織纖維化,是因為后者可活化成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,使ECM合成增多。本研究發(fā)現(xiàn),SSc 模型組小鼠皮膚Wnt3a和β-catenin 表達(dá)升高,與上述研究結(jié)果一致;刺山柑總生物堿450 mg/kg 可降低系統(tǒng)性硬皮病小鼠皮膚Wnt3a的濃度;450 mg/kg和900 mg/kg可降低β-catenin mRNA 和蛋白表達(dá),提示刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮病Wnt/β-catenin 信號通路的過度激活有一定抑制作用。

    WISP1,又名CCN4,是Wnt/β-catenin 下游靶蛋白,有研究表明,多組織器官的纖維化過程都與WISP1水平的異常升高有關(guān)[18]。本實驗發(fā)現(xiàn),WISP1 在SSc模型組小鼠皮膚組織表達(dá)升高,提示W(wǎng)ISP1 可能參與系統(tǒng)性硬皮病皮膚纖維化的形成;刺山柑總生物堿組WISP1 表達(dá)與SSc 模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示刺山柑總生物堿可能不會改變系統(tǒng)性硬皮病小鼠WISP1的異常升高。

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