丙氨酰谷氨酰胺在大鼠心肌梗死中的保護(hù)作用及其機制

鮑宏剛，王勇敢，朱立強，徐志勇，蘇芳菊，楊海青*

(1解放軍中部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院心內(nèi)科，山西 大同 037000；2聯(lián)勤保障部隊解放軍第940醫(yī)院心血管內(nèi)科，蘭州 730050)

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是細(xì)胞在應(yīng)激原刺激作用下合成的一組蛋白質(zhì)，以分子伴侶形式直接作用于蛋白分子，通過影響細(xì)胞信號途徑發(fā)揮抗應(yīng)激和細(xì)胞保護(hù)作用。其中，HSP70家族作為熱休克蛋白家族中重要組成部分，在生物細(xì)胞中含量最高，可誘導(dǎo)性最強，具有保護(hù)細(xì)胞免受刺激損傷，促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)、抗炎、抗凋亡、耐受缺血或缺氧損傷等生物學(xué)性能[1-3]。熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSP70升高可使心肌梗死面積減少，使缺血再灌注心肌收縮功能恢復(fù)加快[4]。HSP70的高表達(dá)具有抗氧化功能，可防止氧化蛋白質(zhì)聚集[5,6]。Kim等[7]將高表達(dá)HSP70基因?qū)氪笫篌w內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織高表達(dá)的HSP70可抑制一氧化氮合酶的活化，減少一氧化氮的生成，從而提高心肌細(xì)胞對缺血的耐受性，減少心肌梗死面積。有研究指出，對谷氨酰胺進(jìn)行預(yù)處理，可誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)，減少擬行心臟外科手術(shù)患者的心肌損傷[8]。自由基損傷是心肌發(fā)生缺血壞死的重要環(huán)節(jié)[9,10]。而HSP70可通過降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)的表達(dá)增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的清除能力，進(jìn)而增強心肌細(xì)胞的抗氧化能力，降低活性自由基的損傷[11,12]。但丙氨酰谷氨酰胺(alanyl-glutamine，Ala-Gln)是否可通過誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)，降低MDA活性，減輕SOD水平而在心肌梗死中起到保護(hù)作用尚未見相關(guān)報道。本研究選擇Ala-Gln作為谷氨酰胺的供體誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，旨在觀察Ala-Gln在大鼠心肌梗死中的作用，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 36只SPF級雄性Wistar大鼠體質(zhì)量為(160±20)g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心(動物使用許可證號2007000524909)。

1.1.2 主要藥品及試劑 注射用丙氨酰谷氨酰胺購自海南靈康制藥有限公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。槲皮素購自美國Sigma公司。氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)購自上海化學(xué)試劑公司。伊文思藍(lán)購自中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站。兔抗鼠HSP70抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。羊抗兔生物素標(biāo)記性二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。DAB染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。MDA試劑盒、SOD試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及動物模型的建立 將36只SPF級雄性Wistar大鼠按隨機數(shù)表法分為4組，即假手術(shù)組、模型組、治療組、槲皮素組，每組9例。將大鼠固定在自制動物手術(shù)臺上，用硫代硫酸鈉脫毛，以3.5%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉，氣管插管并連接海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn)的小動物呼吸機。逐層打開胸腔，剪開心包，找到左冠狀動脈主干后，以其為標(biāo)志，于左心耳下方2 mm處進(jìn)針，無損傷帶針縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，當(dāng)結(jié)扎區(qū)域心肌變白，心電圖肢導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段上抬≥0.2 mV，則判斷為造模成功。36只SD大鼠均順利完成整個實驗。造模成功后，治療組按0.75 mg/kg給予Ala-Gln溶液(Ala-Gln+生理鹽水配成濃度為3.3%的溶液)，腹腔注射1次/d，連續(xù)7 d；槲皮素組在給予Ala-Gln溶液前6 h，按100 mg/kg給予槲皮素(槲皮素是分布于植物界的一種黃酮類復(fù)合物，具有廣泛的生物學(xué)功能，是一種HSP70抑制劑)腹腔注射，注意在使用時需先溶解于DMSO中，1次/d，連續(xù)7 d；假手術(shù)組在相同冠狀動脈部位只穿線，不結(jié)扎冠狀動脈；模型組與假手術(shù)組分別于腹腔注射與槲皮素組等量的生理鹽水。

1.2.2 大鼠心肌組織病理改變 取部分心肌組織置于中性甲醛溶液中固定24 h后，石蠟包埋并切成5 μm薄片，用蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片在缺血區(qū)隨機選擇4個高倍視野(×400)，觀察心肌組織學(xué)變化。

1.2.3 免疫組化法觀察大鼠心肌組織中HSP70的表達(dá) 將心肌組織切片置于68 ℃烤箱中烤60 min后行免疫組化染色。在光鏡下觀察HSP70染色情況，每張切片隨機取4個非重疊無血管視野(×400)，利用Image-Proplus 5.0圖像掃描軟件進(jìn)行圖像分析，測定每個視野下陽性物質(zhì)的平均光密度值。平均光密度值=累積光密度值/面積。

1.2.4 MDA和SOD的測定 通過脫臼法處死大鼠后立即取心臟組織100 mg，按1∶9的比例加入生理鹽水，玻璃勻漿器低溫下勻漿，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，取上清液。分別采用黃嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸顯色法測定MDA和SOD，嚴(yán)格按試劑盒操作要求進(jìn)行。

1.2.5 心肌梗死面積的測量 右心室取血后取出心臟，保留部分主動脈，經(jīng)主動脈逆行灌注心臟，以生理鹽水沖洗心臟，再次在相同部位結(jié)扎左冠狀動脈前降支，并用Evans blue染色劑從主動脈逆行灌注心臟，區(qū)分非缺血部位和缺血部位，而后放入-20 ℃冰箱中冷凍15 min至心臟組織僵硬。垂直心臟長軸方向，以手術(shù)刀切片，每片厚約1 mm，剔取左心室，濾紙干燥，電子天平稱重測得左心室重量。再剔取左心室缺血部位稱重并計算缺血心肌重量占左心室重量的百分比(以下簡稱IM/LV)。將左心室缺血部位切片放入1% TTC中，37 ℃水浴30 min，區(qū)分非梗死部位和梗死部位，剔取梗死區(qū)域的心肌組織，濾紙干燥后稱重，并計算梗死心肌重量占左心室重量的百分比(以下簡稱NEC/LV)。

1.2.6 血清心肌酶的測定 待大鼠處死后，開胸顯露心臟，右心室取血10 ml，離心后血漿置于-20 ℃冰箱中保存。血漿標(biāo)本解凍后應(yīng)用Hitach 7060型全自動生化分析儀測定肌酸磷酸激酶(creatine kinase，CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，試劑購自科華-東菱公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心臟染色結(jié)果

大鼠心臟組織Evans blue染色結(jié)果可見，非缺血部位呈藍(lán)色，缺血部位則不染色；TTC染色結(jié)果可見，非梗死部位呈深紅色，梗死部位則呈蒼白色(圖1)。

圖1 4組大鼠心臟TTC染色結(jié)果

2.2 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠心肌纖維清晰，排列規(guī)則，無斷裂和缺血壞死(圖2A)。模型組、槲皮素組見片狀心肌組織壞死溶解，其間可偶見島狀或細(xì)帶狀存活心肌組織，肌纖維斷裂，肌絲斷裂溶解，心肌纖維扭曲、心肌細(xì)胞腫脹，核固縮或溶解(圖2B，D)。治療組心肌組織壞死明顯減輕(圖2C)。

圖2 4組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

2.3 大鼠心肌組織中HSP70的含量

正常心肌細(xì)胞的HSP70分布于心肌細(xì)胞胞漿中，免疫組化染色陽性呈棕黃色。4組HSP70免疫組化染色及半定量分析結(jié)果見圖3。其中，假手術(shù)組、模型組、槲皮素組HSP70表達(dá)水平分別為(0.154±0.036)、(0.151±0.033)、(0.151±0.025)ng/ml，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療組HSP70含量為(0.286±0.056)ng/ml，較其余各組均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 4組大鼠心肌組織HSP70免疫組化染色結(jié)果

2.4 大鼠心肌組織中MDA、SOD的含量

與模型組和槲皮素組相比較，治療組和假手術(shù)組中MDA水平明顯低于模型組和槲皮素組(P<0.01)，治療組與假手術(shù)組MDA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。治療組和假手術(shù)組中SOD水平明顯高于模型組和槲皮素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且治療組中SOD水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.01；表1)。

表1 4組大鼠心肌細(xì)胞中MDA和SOD含量比較

2.5 大鼠心肌缺血、心肌梗死面積百分比

假手術(shù)組中未見心肌缺血及心肌壞死，模型組較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯的心肌缺血及壞死，而治療組心肌缺血及壞死面積較模型組明顯縮小(P<0.01)，槲皮素組給予槲皮素后心肌缺血面積及梗死面積較治療組增大(P<0.01)，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表2)。

表2 4組大鼠心肌缺血和心肌梗死面積百分比比較

2.6 大鼠血清中CK、AST、LDH的含量

血清CK、AST、LDH在模型組、治療組、槲皮素組中的含量均高于假手術(shù)組(P<0.01)，且治療組CK、AST、LDH含量較模型組和槲皮素組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而槲皮素組與模型組CK、AST、LDH含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表3)。

表3 4組大鼠心肌細(xì)胞中CK、AST、LDH含量比較

2.7 HSP70與MDA、SOD、CK、AST、LDH、IM/LV、NEC/LV的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，大鼠心肌組織中HSP70的含量與MDA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.811，P<0.001),與SOD呈正相關(guān)(r=0.973，P<0.001)；大鼠心肌組織中HSP70的含量與CK、AST、LDH呈負(fù)相關(guān)(r=-0.827、-0.862、-0.888，均P<0.001)，與IM/LV、NEC/LV呈負(fù)相關(guān)(r=-0.908、-0.694，均P<0.001)。

3 討 論

自由基損傷是心肌發(fā)生缺血壞死的重要環(huán)節(jié)[10，11]。氧自由基對心肌的損害主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，即氧自由基與心肌細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸結(jié)合，引起脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物，進(jìn)而引起細(xì)胞生物分子結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞功能損傷，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。MDA是氧自由基生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，可間接反映心肌組織中氧自由基含量的變化；而SOD是生物體產(chǎn)生的一種天然抗氧化物，通過歧化反應(yīng)清除體內(nèi)生成的氧自由基，對氧自由基損傷具有保護(hù)作用[13，14]。

HSP70家族作為HSP家族中重要組成部分，在生物細(xì)胞中含量最高，可誘導(dǎo)性最強，具有保護(hù)細(xì)胞免受刺激損傷，促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)及抗炎、抗凋亡、耐受缺血或缺氧損傷等生物學(xué)功能[1-3]。HSP70高表達(dá)可減少心肌梗死面積，改善心肌收縮功能[3，6]。HSP70高表達(dá)還可減少擬行心臟外科手術(shù)患者的心肌損傷[9]。HSP70可通過降低MDA的表達(dá)、增強SOD的清除能力進(jìn)而起到增強心肌細(xì)胞的抗氧化能力，降低活性自由基的損傷的作用[11，12]。由此推測，HSP70的誘導(dǎo)劑Ala-Gln可能對缺血心肌具有一定的保護(hù)作用。

本實驗通過手術(shù)結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支的方法建立大鼠缺血心肌模型，通過大鼠心肌病理染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞壞死，且部分心肌組織出現(xiàn)了纖維化，心肌缺血面積、梗死面積、心肌酶含量較假手術(shù)組增加，模型組MDA表達(dá)水平高于假手術(shù)組，而假手術(shù)組SOD含量則較模型組降低。上述結(jié)果表明，造模成功后心肌細(xì)胞發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物MDA，而且SOD表達(dá)的減少，使心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力降低，造成心肌損傷。此外，治療組造模后30 min給予腹腔注射Ala-Gln，其心肌組織HSP70表達(dá)水平顯著高于其他3組，雖然心肌缺血面積、心肌梗死面積及心肌酶的含量高于假手術(shù)組，但與模型組比較卻下降，且MDA水平較模型組下降，SOD水平卻較模型組升高，提示Ala-Gln對心肌梗死具有保護(hù)作用，這可能與誘導(dǎo)心肌組織中HSP70表達(dá)、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、提高心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力有關(guān)。而槲皮素組在給予HSP70抑制劑后，HSP70的表達(dá)水平較治療組降低，且心肌缺血面積、心肌壞死面積、心肌酶、MDA、SOD與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明Ala-Gln對心肌梗死的保護(hù)作用主要是通過誘導(dǎo)心肌組織HSP70表達(dá)、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、提高心肌細(xì)胞清除氧自由基能力來實現(xiàn)的，抑制劑抑制了HSP70的表達(dá)，導(dǎo)致保護(hù)作用也隨之消失。

綜上所述，Ala-Gln對心肌梗死具有保護(hù)作用，該保護(hù)作用主要表現(xiàn)在減少心肌缺血面積、減少心肌梗死面積以及降低心肌酶的含量。其機制可能與Ala-Gln誘導(dǎo)心肌組織HSP70表達(dá)、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、提高心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力有關(guān)。Ala-Gln目前在臨床上已被廣泛應(yīng)用，具有肯定的安全性和有效性，故Ala-Gln誘導(dǎo)HSP70表達(dá)升高用于心肌梗死的防治具有潛在的臨床價值。