奧拉西坦對心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

關(guān)園，關(guān)悅，曾令達(dá)，徐芳，李鐵成*

(錦州醫(yī)科大學(xué)：1附屬第三醫(yī)院麻醉科，3解剖教研室，遼寧 錦州121000；2錦州市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 錦州121000)

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion，MI/RI)是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，其中涉及到多種信號通路和多種氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]。近些年實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，MI/RI的發(fā)生機(jī)制與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和能量代謝障礙均有密切關(guān)系，且細(xì)胞凋亡在MI/RI的整個(gè)過程中一直存在[2]。奧拉西坦(oxiracetam)是一種環(huán)狀羥基-氨基丁酸衍生物，與吡拉西坦類似，可作為認(rèn)知增強(qiáng)劑改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。奧拉西坦進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可迅速被分解，其產(chǎn)物能促進(jìn)組織合成大量的磷酰乙醇胺和磷酰膽堿，進(jìn)而抑制磷脂分解，維持線粒體穩(wěn)定[4]。有研究表明，奧拉西坦還可以增強(qiáng)乙酰膽堿的釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)、加強(qiáng)活性氧自由基清除[5]、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[6]。奧拉西坦的藥理特性決定其可以對抗由于電休克、缺氧等情況造成的學(xué)習(xí)行為或記憶損害[7]。同時(shí)有研究表明，奧拉西坦可以重建未損傷的組織結(jié)構(gòu)，減輕及保護(hù)腦組織的缺血/再灌注損傷[8]。本研究從細(xì)胞凋亡的角度，探討奧拉西坦對MI/RI的作用，并且初步分析其機(jī)制，以豐富奧拉西坦的器官保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用夯實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

SD大鼠32只，雌雄不限，體質(zhì)量230～260 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。奧拉西坦膠囊(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，中國石家莊)；氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)(Amresco公司，美國)；Bcl-2、Bax、β-actin一抗和二抗(Proteintech公司，美國)；BCA法蛋白檢測試劑盒、顯影劑(北京鼎國生物有限公司，中國北京)；原位末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick，TUNEL)檢測、核蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國上海)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondi alldehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國南京)；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生科技技術(shù)有限公司，中國上海)。超聲波細(xì)胞破碎儀(SONICS公司，美國)；切片機(jī)、烤片機(jī)、生物顯微鏡(LEICA，德國)；呼吸機(jī)、心電監(jiān)護(hù)儀(成都泰盟公司，中國成都)；垂直電泳系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光凝膠成像(國美伯樂)；高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 32只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)表法分為4組，每組8只：(1)假手術(shù)組；(2)MI/RI組；(3)低劑量組(奧拉西坦30 mg/kg)；(4)高劑量組(奧拉西坦50 mg/kg)。手術(shù)前均正常飼養(yǎng)，低劑量組和高劑量組的16只大鼠除正常飼養(yǎng)外，通過灌胃方式給予對應(yīng)劑量的奧拉西坦，1次/d，連續(xù)7 d。

大鼠手術(shù)前1天晚上開始禁食不禁飲，麻醉后固定大鼠，進(jìn)行氣管插管，連接呼吸機(jī)，監(jiān)測心電圖。在大鼠胸骨左緣3、4肋間鈍性分離組織，開胸后充分顯露心臟，剔除心包，找到左冠狀動(dòng)脈前降支。假手術(shù)組僅需要用5-0無損傷縫合線做穿線處理；MI/RI組、低劑量組和高劑量組用5-0無損傷縫合線在左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎，使心電圖ST-T抬高，放松后ST-T回落50%標(biāo)志造模成功。MI/RI組、低劑量組和高劑量組均結(jié)扎30 min，再灌注60 min。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定 術(shù)后立即在各組大鼠右心房取血，靜止，離心，吸取上層血清，分別標(biāo)記并存放在-80℃冰箱中。待所有血清備好后，依照試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中SOD、MDA、LDH、CK-MB、IL-6的含量。

1.2.3 NBT染色 取血后每組隨機(jī)選取3只大鼠，將心臟取下后去除心房及右心室，放入-20℃冰箱速凍1 h，待組織稍硬后取出，將心室切成等厚的5片，放入預(yù)配置的0.1%NBT中，37℃恒溫水浴染色。正常心肌是NBT著色部分，顯示成暗紫色；NBT不著色部分是梗死心肌，顯示成紅色或蒼白色。以此辨別梗死區(qū)與非梗死區(qū)心肌。心肌梗死面積百分比=梗死心肌面積/心肌總面積×100%。

1.2.4 TUNEL染色 每組取5只大鼠，取部分心肌組織，置于4%多聚甲醛液，制作成石蠟切片。TUNEL染色時(shí)，2次脫蠟、浸泡復(fù)水、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗、孵育，DAB避光顯色，蘇木素復(fù)染，在生物顯微鏡下拍照。在每張切片中隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)。心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。

1.2.5 蛋白表達(dá)的檢測 每組取5只大鼠，取部分心肌組織提取核蛋白。通過BCA試劑盒來檢測蛋白濃度，制作蛋白樣品。電泳、轉(zhuǎn)膜、BSA封閉、洗膜。切割后分別和制備的Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)一抗充分混勻，孵育過夜。洗膜，雜交，再次洗膜。加入ECL顯色后，檢測電泳條帶。Bcl-2/Bax比值的變化是細(xì)胞凋亡水平的標(biāo)志。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠血清LDH和CK-MB含量比較

與假手術(shù)組相比，MI/RI組大鼠血清中LDH和CK-MB含量顯著增加(P<0.05)；與MI/RI組相比，低劑量組和高劑量組大鼠血清中LDH和CK-MB含量顯著降低(P<0.05；表1)。

表1 4組大鼠血清LDH和CK-MB含量比較

2.2 4組大鼠心肌梗死面積比較

假手術(shù)組均染成暗紫色，沒有發(fā)生心肌梗死。與假手術(shù)組相比，MI/RI組大鼠心肌梗死面積百分比顯著增加(36.2%和0.0%，P<0.05)；與MI/RI組相比，低劑量組和高劑量組大鼠心肌梗死面積百分比顯著降低(36.2%和13.6%和22.3%，P<0.05；圖1)。

圖1 4組大鼠心肌梗死面積比較

2.3 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較

與假手術(shù)組相比，MI/RI組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加(45.4%和7.9%，P<0.05)；與MI/RI組相比，低劑量組和高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(45.4%和30.6%和21.3%，P<0.05；圖2)。

圖2 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較

2.4 4組大鼠血清IL-6、SOD、MDA含量比較

與假手術(shù)組比較，MI/RI組血清中IL-6和MAD含量顯著增加(P<0.05)，而SOD顯著減少(P<0.05)；與MI/RI組比較，低劑量組和高劑量組大鼠血清中IL-6和MAD含量顯著降低(P<0.05)，而SOD顯著增加(P<0.05；表2)。

表2 4組大鼠血清IL-6、SOD、MDA含量比較

2.5 4組大鼠心肌組織Bcl-2/Bax比值比較

與假手術(shù)組比較，MI/RI組大鼠的Bcl-2/Bax比值顯著下降(0.19和1.96，P<0.05)；與MI/RI組比較，低劑量組和高劑量組大鼠的Bcl-2/Bax比值顯著上升(0.19和0.47和1.16，P<0.05；圖3)。

圖3 4組大鼠心肌組織Bcl-2/Bax比值比較

3 討 論

早期的急性心肌梗死患者，往往可以通過藥物、手術(shù)及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)等方法恢復(fù)血管再通、縮小梗死面積，從而降低心臟不良預(yù)后[9]。但急性心肌梗死患者在恢復(fù)有效灌注后，反而會(huì)驟然增加心肌損傷[10]，甚至不可逆[11]，即MI/RI[12]。線粒體會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基(oxygen free radical，OFR)，這是一類具有超高生物學(xué)活性的含氧化合物[13]。當(dāng)組織發(fā)生缺氧時(shí)，線粒體會(huì)迅速生成大量OFR，超高水平的OFR會(huì)對核酸、蛋白分子產(chǎn)生氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，這種現(xiàn)象被稱為氧化應(yīng)激。在發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，大量的活性氧與線粒體DNA直接接觸，可以使DNA雙鏈斷裂或丟失，DNA損傷后可以直接激活Bcl-2家族的促凋亡蛋白在線粒體膜表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)源性細(xì)胞凋亡誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)[14]。Bcl-2/Bax比值是決定細(xì)胞是否凋亡的關(guān)鍵[15]。

本研究中采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立了大鼠MI/RI模型，結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，MI/RI組心肌梗死面積百分比、心肌細(xì)胞凋亡率、血清中CK-MB、LDH、MDA和IL-6含量均顯著增加，而SOD和Bcl-2/Bax比值顯著減少?？梢钥闯?，缺血細(xì)胞的線粒體膜穩(wěn)定性及氧自由基清除能力下降，心肌存在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過奧拉西坦預(yù)處理的大鼠發(fā)生MI/RI時(shí)，心肌梗死面積百分比、心肌細(xì)胞凋亡率、血清中CK-MB、LDH、MDA和IL-6含量均顯著降低，而SOD和Bcl-2/Bax比值顯著增加，提示奧拉西坦對MI/RI具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，奧拉西坦可促進(jìn)活性氧自由基清除，維持線粒體膜穩(wěn)定，下調(diào)氧化應(yīng)激反應(yīng)水平，抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，降低炎性反應(yīng)。