FHIT基因在胃癌中的甲基化表達及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

楊 健，胡宏波，賈安平，梁秀蘭，劉振鵬，詹前美

(柳州市柳鐵中心醫(yī)院消化內(nèi)科1，檢驗科2，廣西 柳州 545007)

FHIT基因在胃癌中的甲基化表達及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

楊 健1，胡宏波2，賈安平1，梁秀蘭1，劉振鵬1，詹前美2

(柳州市柳鐵中心醫(yī)院消化內(nèi)科1，檢驗科2，廣西 柳州 545007)

目的探討胃癌(GC)組織中脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因的甲基化表達及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。方法選取我院胃鏡檢查診斷為胃癌的74例患者及36例慢性胃炎患者為研究對象。應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)檢測兩組胃黏膜中FHIT基因的甲基化狀態(tài)，對比相應(yīng)的病理特征并進行分析。結(jié)果胃癌組與對照組組織中FHIT基因甲基化陽性率分別為51.4%及5.6%，胃癌組FHIT基因甲基化陽性率顯著高于對照組(P＜0.05)，且甲基化表達與GC患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位及組織學(xué)類型無關(guān)(P＞0.05)，與病變的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論FHIT基因甲基化修飾參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，可反映胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的程度。

胃癌；FHIT基因；甲基化；病理

胃癌(GC)是消化道最常見的惡性腫瘤，全球大概每年新增90萬胃癌患者。眾所周知，胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的多階段的過程，是多種相關(guān)基因發(fā)生失常的結(jié)果。染色體3p14.2的脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因是一個候選腫瘤抑制基因，該基因改變、轉(zhuǎn)錄異常和表達丟失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著密切的關(guān)系[1]。我們采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)對胃癌組織中的FHIT基因啟動子區(qū)甲基化狀況進行檢測，并與其臨床病理特征對比，旨在探討FHIT基因甲基化狀態(tài)及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，揭示FHIT基因甲基化狀態(tài)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2006年1月至2009年10月我院門診及住院患者，經(jīng)胃鏡檢查并經(jīng)手術(shù)及病理證實為GC的患者74例，男46例，女28例，年齡36～87歲，平均58.5歲；高分化胃癌18例，中分化胃癌21例，低分化胃癌35例；腫瘤直徑小于5cm 53例，大于5cm 21例；賁門胃底11例，胃體26例，胃竇37例；臨床病理學(xué)分期采用國際抗癌聯(lián)盟1997修訂的TNM分期標準，其中Ⅰ期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期20例，Ⅳ期22例。對照組36例，男16例，女20例，年齡28～65歲，平均45.4歲，均為胃鏡下診斷慢性淺表性胃炎(CSG)患者。所有病例均取典型病變組織一份，樣本離體后30min內(nèi)均迅速放置于-80℃冰箱中。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 參照大連TaKaRa公司試劑盒說明書進行，提取產(chǎn)物用美國Bio-Rad公司SmartSpec plus核酸測定儀檢測DNA的濃度和純度，如OD260/OD280在1.6～1.8之間則置于-20℃的冰箱備用。

1.2.2 甲基化檢測 亞硫酸氫鹽修飾參照美國Epigentek公司產(chǎn)品說明書進行。將已修飾的DNA，分別用甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物進行PCR擴增。引物設(shè)計參照文獻[2]，引物和擴增參數(shù)見表1。PCR反應(yīng)體系的構(gòu)成:Taq酶0.5 μl，模板 DNA 2.5 ng，上游引物(20 μmol/L)1 μl，下游引物(20 μmol/L)1 μl，GC Buffer I 25 μl，dNTP(含 Mg2+)8 μl，滅菌蒸餾水加至50 μl，共35個循環(huán)，最后72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖電泳，80 V，120min，溴化乙錠染色，結(jié)果經(jīng)美國Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

表1 FHIT基因引物和擴增參數(shù)

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS 14.0進行χ2檢驗或者Fisher精確檢驗，判定標準：P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。

2 結(jié)果

2.1 FHIT基因的PCR產(chǎn)物 FHIT基因MSP和非甲基化特異性PCR片段長度均為74 bp，上述片段長度均與預(yù)期相符(見圖1)。

圖1 UreB基因PCR產(chǎn)物和FHIT基因的MSP分析

2.3 FHIT基因的甲基化狀態(tài) 74例GC組織中FHIT基因啟動子區(qū)甲基化陽性為38例，檢出率為51.4%，其中完全甲基化9例。CSG組織中FHIT基因啟動子區(qū)甲基化陽性為2例，檢出率為5.6%，均為部分甲基化。GC組織與CSG組織FHIT基因甲基化檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 FHIT基因的甲基化狀態(tài)在胃癌組織、慢性胃炎組織中的表達

2.4 FHIT基因甲基化與GC臨床病理特征的關(guān)系 統(tǒng)計學(xué)分析顯示，F(xiàn)HIT基因甲基化與GC患者甲基化表達與GC患者的與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位及組織學(xué)類型無關(guān)(P＞0.05)，與病變的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。見表3。

表3 FHIT基因甲基化與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

胃癌是人體中最多發(fā)、危害最大的惡性腫瘤之一。而我國是胃癌高發(fā)區(qū)，在我國胃癌年發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤首位，是世界平均水平的兩倍多。大量的研究表明，胃癌的形成常伴隨著抑癌基因啟動子區(qū)域CpG島的異常甲基化修飾。脆性組氨酸三聯(lián)體基因(Fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)是1996年Ohta等[3]和Zimonjic等[4]發(fā)現(xiàn)的一種新的候選抑癌基因，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有該基因的異常。FHIT基因位于人類染色體3p14.2上，其cDNA由10個外顯子組成，外顯子5～9組成一個長約500 bp的開放性閱讀框，編碼是由147個氨基酸組成的相對分子量為16.8 kD的蛋白質(zhì)。該基因表達蛋白參與一系列的細胞進程，包括對細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和微管活動的調(diào)節(jié)以及二腺苷三磷酸(AP3A)的水解等[5]。由FHIT基因啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的表達靜默被認為是引起GC發(fā)生的分子機制之一，并且已經(jīng)在GC組織中得到了證實[2]。Leal等[6]對78例胃癌及癌旁組織進行FHIT基因甲基化檢測，結(jié)果胃癌組織甲基化陽性率為53.9%。戴觀榮等[7]檢測88例胃癌組織FHIT基因甲基化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性患者為35例(40%)。本組檢測結(jié)果顯示：FHIT基因在74例GC組織中有38例發(fā)生甲基化，甲基化率為51.4%，在胃炎胃黏膜組織甲基化陽性率為5.6%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；胃癌組甲基化率與Leal等[6]的研究結(jié)果53.9%比較接近，但與參考文獻[7-8]報道的40%和62%有一定差異，可能與患者的遺傳背景和實驗方法的差異有關(guān)。我們進一步分析甲基化表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示：甲基化表達與GC患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位及組織學(xué)類型無關(guān)(P＞0.05)，與病變的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。根據(jù)胃癌的TNM分期標準，腫瘤的浸潤深度、胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移分別是3個重要的方面，它們不但反映病變的早晚，是臨床判斷預(yù)后的重要標準，也直接反映出腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的能力，本研究結(jié)果表明癌組織中FHIT的甲基化表達與胃癌的TNM分期有相關(guān)性，這提示FHIT的甲基化與胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移的能力相關(guān)，有可能成為臨床判斷胃癌患者預(yù)后的指標之一。由于FHIT的甲基化與胃癌的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性，則研究它影響胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移的途徑不僅能探索研究腫瘤轉(zhuǎn)移的機制，而且對臨床防治腫瘤有重要意義。

綜上所述，筆者認為FHIT甲基化參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，且與臨床病理有一定關(guān)系。FHIT基因甲基化修飾在GC發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可作為反映胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標之一。

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Methylation of fragile histidine triad gene in gastric cancer and its association with helicobacter pylori

YANG Jian,HU Hong-bo,JIA An-ping,et al.Department of Labortory Medicine,the Central Hospital of Liuzhou Railroad，Liu?zhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the methylation of fragile histidine triad(FHIT)gene and explore possible relationship between FHIT methylation and clinicopathological features of gastric carcinoma(GC).Methods74 cases with GC and 36 cases with chronic gastritis diagnosed by gastroscopy were selected as study cases.Methylation specific PCR(MPC)was performed to test the methylation status of FHIT gene in the gastric mucosa of the two groups.The corresponding clinicopathological features between them was also contrast analyzed.ResultsThe methylation rate of FHIT in tissues from GC group and control group was 51.4%and 5.6%respectively.The methylation rate of FHIT in GC was significantly higher than that in control group(P＜0.05).FHIT methylation was related to the depth of invasion,metastasis in lymph node and metastasis in distance(P＜0.05),while it has no relationship with age,gender,tumor size,tumor location and histological type.ConclusionMethylation of FHIT gene takes part in the progression of GC and it can reflect the degree of invasion and metastasis in GC.

Gastric carcinoma;Fragile histidine triad FHIT gene;Methylation;Pathology

R735.2

A

1003—6350（2011）10—041—03

楊 ?。?972—），男，廣西玉林市人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事消化道疾病的診斷。

2011-02-01)