胰島素腹腔注射對2型糖尿病KKAy小鼠異常血脂調(diào)節(jié)的影響

夏婷 高關(guān)心 夏慧琳 孫洪范 俞蘭 都莉娜 孫佳慧 楊詩鈺 常潔

1內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學工程處，呼和浩特010017；2中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所，天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室，天津300192；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學計算機信息學院，呼和浩特010110

0 引 言

2019 年，世界衛(wèi)生組織發(fā)布全球十大健康威脅，其中包含糖尿病的非傳染性疾病位列名單第2 項，糖尿病已發(fā)展成為嚴重影響人類健康的疾病。2 型糖尿病患者的胰島素分泌紊亂、糖脂代謝異常，會對全身多組織、多器官造成損害。有研究結(jié)果指出，胰島素分泌異?；蛞葝u素抵抗致使來源于血糖的脂肪過多地儲存于肝細胞內(nèi)，進而產(chǎn)生脂肪肝，同時體內(nèi)脂肪分解加速、合成減少，血漿中脂質(zhì)增多，從而加重2 型糖尿病[1-4]。此外，肥胖與胰島素抵抗、2 型糖尿病之間關(guān)系密切[5-8]。2 型糖尿病及胰島素抵抗導致體內(nèi)糖脂代謝紊亂，血脂含量改變促進或加重2 型糖尿病的發(fā)展，而肥胖進一步加重胰島素抵抗，嚴重影響了患者的身體健康。

相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與皮下注射相比，腹腔注射胰島素對2 型糖尿病模型KK 小鼠具有更好的血脂調(diào)節(jié)能力[9]。KKAy 小鼠來源于KK 小鼠，但編碼基因不同，由a/a 純合子變異為Ay/a 雜合子，且KKAy小鼠也具有代謝異常綜合征，包括肥胖和高血糖等。決定KKAy 小鼠發(fā)展為糖尿病的主要因素有遺傳和環(huán)境兩方面，與2 型糖尿病的發(fā)展途徑相似[10]。為明確胰島素腹腔注射對2 型糖尿病KKAy 小鼠異常血脂調(diào)節(jié)的影響，本研究對2 型糖尿病KKAy 小鼠進行胰島素腹腔注射治療，并在治療中期轉(zhuǎn)為皮下注射，觀察注射方案改變對小鼠體質(zhì)量、血糖及血脂的影響，并與實驗期間全程皮下注射組進行對比。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

基礎(chǔ)飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司），高脂高糖飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司），生物合成人胰島素注射液[諾和諾德（中國）制藥有限公司，300 IU/3 ml（筆芯）]，重組甘精胰島素注射液[甘李藥業(yè)股份有限公司，300 IU/3 ml（筆芯）]，甘油三酯（triglyceride，TG）測試盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測試盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-densitylipoproteincholesterol，HDL-C）測試盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測試盒（南京建成生物工程研究所）。

健康清潔級C57BL/6J 雄性小鼠6 只，5 周齡，體質(zhì)量范圍26.5～32.6 g，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK（蒙）2015-0001；健康無特定病原體級KKAy 雄性小鼠21 只，5 周齡，體質(zhì)量范圍26.3～33.5 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2014-0004。實驗前小鼠均采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～55%，自由飲水。

DA-3 血糖儀及試紙（三諾生物傳感股份有限公司），Elx808 IU 全自動酶標儀（美國Bio-Tek 公司），TP1020 生物組織自動脫水機、RM2235 石蠟切片機（德國Leica 公司），TB-718 生物組織自動包埋機、TK-218Ⅱ恒溫攤片烤片機（湖北泰維科技實業(yè)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 2 型糖尿病小鼠模型的建立及實驗分組

（一）2 型糖尿病小鼠模型的建立

采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)KKAy 小鼠，待小鼠出現(xiàn)多飲多尿、毛發(fā)油膩等癥狀，且所測隨機血糖值≥13.9 mmol/L 時表明2 型糖尿病模型建模成功。

（二）實驗分組

將建模成功的KKAy 小鼠隨機分為3 組：腹腔注射組（n=6）、皮下注射組（n=6）和發(fā)病未治療組（n=3）。同時選取健康C57BL/6J 小鼠作為正常組（n=6），健康KKAy 小鼠作為未發(fā)病組（n=6）。

1.2.2 胰島素治療方案

按照實驗分組進行胰島素注射治療，治療分為兩個階段。其中，發(fā)病未治療組、正常組和未發(fā)病組不予注射。

第一階段為期6 周，腹腔注射組和皮下注射組分別進行胰島素腹腔和皮下注射。兩組均每天注射5 次，第1 次與第2 次注射間隔0.5 h，第2 次與第3 次注射間隔3.5 h，其余注射時間點間隔均為4 h。兩組均在第1 次注射重組甘精胰島素注射液（腹腔注射組：0.250 IU/g；皮下注射組：0.125 IU/g），其余時間點均注射生物合成人胰島素注射液（腹腔注射組：0.125 IU/g；皮下注射組：0.075 IU/g）。

第二階段為期4 周，腹腔注射組和皮下注射組均進行胰島素皮下注射，注射方案與第一階段皮下注射相同。

治療期間除未發(fā)病組小鼠喂食基礎(chǔ)飼料外，其余組小鼠均喂食高脂高糖飼料。

1.2.3 檢測指標

每兩周測量小鼠體質(zhì)量1 次；采集小鼠尾尖血，血糖儀測定空腹血糖和餐后2 h 血糖，并采用對應的試劑盒測定血清中的TG、TC、HDL-C 和LDL-C 含量。治療結(jié)束后，取小鼠肝臟組織，經(jīng)固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后進行蘇木精-伊紅染色，并采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對圖像進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，符合偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（QR）]表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis檢驗），以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量變化情況

在建立動物模型前，各組小鼠的體質(zhì)量約30 g。由表1 可知，腹腔注射組改變注射方案對小鼠體質(zhì)量無明顯影響，且各組小鼠治療第6 周與第10 周的體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.2 血糖變化情況

2.2.1 空腹血糖

由表1 可知，腹腔注射組改變注射方案對小鼠空腹血糖無明顯影響，對比未發(fā)病組發(fā)現(xiàn)，在整個治療過程中腹腔注射組小鼠空腹血糖控制良好；治療第10 周正常組小鼠空腹血糖值出現(xiàn)升高的現(xiàn)象，且與第6 周相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；發(fā)病未治療組小鼠空腹血糖值從第6 周起降至正常范圍。

2.2.2 餐后2 h 血糖

由表1 可知，腹腔注射組改變注射方案對小鼠餐后2 h 血糖無明顯影響，與上述空腹血糖結(jié)果類似，在整個治療過程中腹腔注射組和皮下注射組小鼠餐后2 h 血糖均控制良好；發(fā)病未治療組小鼠餐后2 h 血糖值持續(xù)較高。

2.3 血脂變化情況

2.3.1 TG

如表2 所示，腹腔注射組改變注射方案對小鼠血清TG 含量無明顯影響，治療第10 周小鼠血清TG 含量與第6 周比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但治療累積效果導致治療第10 周小鼠血清TG 含量低于治療第2 周，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且治療第10 周腹腔注射組的血清TG 含量與未發(fā)病組相近；皮下注射組結(jié)果也證明，全程皮下注射胰島素可明顯降低血清TG 含量（P＜0.05）。

2.3.2 TC

如表2 所示，腹腔注射組改變注射方案對小鼠血清TC 含量無明顯影響，注射方案改變前后血清TC含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療前6 周，與發(fā)病未治療組相比，腹腔注射組和皮下注射組均在一定程度上降低了血清TC 含量，且皮下注射組優(yōu)于腹腔注射組；但在治療第10 周，腹腔注射組和皮下注射組小鼠血清TC 含量仍明顯高于未發(fā)病組。

2.3.3 HDL-C

如表2 所示，腹腔注射組改變注射方案對小鼠血清HDL-C 含量影響較大，腹腔注射治療后血清HDL-C 含量大幅升高，治療第6 周的血清HDL-C含量高于治療第2 周（P＜0.05），并與未發(fā)病組相近，亦高于同期皮下注射組和發(fā)病未治療組；改變注射方案后，腹腔注射組的血清HDL-C 含量降低，治療第10 周的血清HDL-C 含量與治療第2 周相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），并與同期皮下注射組相近。

2.3.4 LDL-C

如表2 所示，腹腔注射組改變注射方案對小鼠血清LDL-C 含量影響較大，腹腔注射治療后血清LDL-C 含量大幅降低，治療第6 周的血清LDL-C 含量低于治療第2 周（P＜0.05），并與未發(fā)病組相近，亦低于同期發(fā)病未治療組和皮下注射組；改變注射方案后，腹腔注射組的血清LDL-C 含量大幅升高，治療第10 周的血清LDL-C 含量高于治療第6 周（P＜0.05），并與同期皮下注射組相近。

表1 不同治療階段各組小鼠的體質(zhì)量及血糖變化[M（QR）]

圖1 治療10 周后各組小鼠肝組織的蘇木精-伊紅染色結(jié)果

2.4 肝臟切片的蘇木精-伊紅染色結(jié)果

如圖1 所示，正常組和未發(fā)病組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞排列整齊緊密，無脂肪空泡及明顯異常；發(fā)病未治療組小鼠肝組織出現(xiàn)大范圍的脂肪空泡，空泡面積占總面積的17.0%，竇狀隙結(jié)構(gòu)完全不清晰，肝細胞體積變大，甚至部分肝細胞形態(tài)消失；腹腔注射組和皮下注射組結(jié)果介于正常組、未發(fā)病組與發(fā)病未治療組之間；腹腔注射組小鼠肝組織出現(xiàn)脂肪空泡，空泡面積占總面積的6.1%，竇狀隙結(jié)構(gòu)較清晰，肝細胞體積變大；皮下注射組小鼠肝組織亦出現(xiàn)脂肪空泡，且數(shù)量較多，空泡面積占總面積的11.3%，竇狀隙結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞體積變大，可見大范圍壞死病灶。

3 討論與結(jié)論

伴有肥胖癥狀的2 型糖尿病是一種難以治愈的代謝疾病，其涉及的糖脂代謝紊亂也是引發(fā)心腦血管疾病、臟器損傷等并發(fā)癥的潛在原因，表現(xiàn)為TG、TC 和LDL-C 含量升高，HDL-C 含量降低[11]。造成糖脂代謝紊亂的主要原因之一是胰島素抵抗，而肥胖也是導致胰島抵抗加重的主要原因[12]。因此，改善胰島素抵抗是糾正糖脂代謝紊亂的方法之一。

胰島素皮下注射對血糖具有較好的調(diào)控作用，但對于改善胰島素抵抗、糾正血脂異常的作用較小[13]。研究人員認為胰島素皮下注射后外周胰島素濃度升高，脂肪分解氧化受到抑制，使得游離脂肪酸含量降低，從而在一定程度上改善了血脂代謝異常。但胰島素皮下注射可能引發(fā)醫(yī)源性高胰島素血癥，導致肝臟脂蛋白酯酶活性降低，HDL-C 含量降低，LDL-C 含量升高[11]。這些研究結(jié)果在本研究中亦有所體現(xiàn)，即胰島素皮下注射組的TG 含量降低，但HDL-C 含量亦降低，LDL-C 含量升高。

胰島素腹腔注射在穩(wěn)定血糖的前提下，對血脂調(diào)控具有不同結(jié)果。本研究中腹腔注射組分階段執(zhí)行胰島素腹腔注射和胰島素皮下注射。完成第一階段的腹腔注射方案后，血脂檢測結(jié)果顯示腹腔注射對HDL-C、LDL-C 和TG 具有調(diào)節(jié)作用。在對KKAy小鼠體質(zhì)量和血糖無影響的條件下，腹腔注射組進行第二階段的胰島素皮下注射，對比同組胰島素皮下注射前后的效果發(fā)現(xiàn)，HDL-C 和LDL-C 數(shù)據(jù)發(fā)生反彈，證明了胰島素腹腔注射對HDL-C 和LDL-C的有效調(diào)節(jié)作用。分析其原因如下：①不同于皮下注射，胰島素腹腔注射可有效模擬正常生理條件，確保肝臟胰島素濃度大于外周血胰島素濃度，進而改善胰島素抵抗，糾正糖代謝異常，為恢復脂代謝正常提供基礎(chǔ)[14-16]。②胰島素腹腔注射可刺激合成胰島素樣生長因子-1，促進脂肪細胞的脂肪分解，提高胰島素的敏感性和利用率，從而改善胰島素抵抗[17-18]。因此，胰島素腹腔注射對于改善脂代謝異常具有一定作用，但關(guān)于胰島素腹腔注射改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)血脂紊亂的機理，尚需進一步的研究證明。同時，本研究中各組小鼠肝臟病理切片的蘇木精-伊紅染色結(jié)果提示，與皮下注射相比，胰島素腹腔注射對脂肪肝形成具有更強的抑制作用，值得進一步的深入研究。

此外，本研究選取了兩種不同遺傳背景的健康小鼠作為對照，即KKAy 小鼠（未發(fā)病組）和C57BL/6J 小鼠（正常組），通過與治療組和發(fā)病未治療組比對，可多維度地探討治療效果。對比發(fā)病未治療組和未發(fā)病組發(fā)現(xiàn)，高脂高糖飼料可促進KKAy 小鼠發(fā)病。對比正常組和未發(fā)病組發(fā)現(xiàn)，飼料對KKAy 小鼠發(fā)病影響較大。C57BL/6J 小鼠（正常組）喂食高脂高糖飼料第6 周血糖維持正常，血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C 含量均未見明顯改變，但第10 周小鼠空腹血糖、TC、TG 指標變化明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。由此可見，短期內(nèi)高脂高糖飲食對正常機體的糖脂代謝不會產(chǎn)生影響，但長期高脂高糖飲食會破壞正常的糖脂代謝。有文獻報道，皮下注射胰島素可降低2 型糖尿病KK 小鼠的血清TC 含量[11]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給藥期間（10 周內(nèi)），腹腔注射和皮下注射胰島素對2 型糖尿病KKAy 小鼠血清TC 含量的調(diào)控作用較小，這可能與KKAy 小鼠持續(xù)高脂高糖飲食及其肥胖特征相關(guān)。

綜上所述，本研究對具有肥胖特征的2 型糖尿病KKAy 小鼠進行胰島素腹腔注射治療，并在治療中期改變胰島素注射方案，發(fā)現(xiàn)胰島素腹腔注射對促進HDL-C 升高和LDL-C 降低具有積極作用，對TG 降低亦具有一定作用，這為具有肥胖特征的2 型糖尿病的治療提供了新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突