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    暗紋東方鲀低溫貯藏期間水分、質地和蛋白質的變化規(guī)律

    2020-11-27 10:47:38汪經邦劉大勇
    食品科學 2020年21期
    關鍵詞:暗紋二硫鍵肌原纖維

    汪經邦,謝 晶,劉大勇

    (1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心(上海海洋大學),上海 201306;3.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心,上海 201306;4.江蘇中洋集團股份有限公司,江蘇 南通 226600)

    暗紋東方鲀(Takifugu obscures)是一種富含蛋白質和必需氨基酸的海淡水洄游魚類[1]。新鮮的暗紋東方鲀極易腐敗變質,采用微生物檢測等傳統(tǒng)方法測定其品質變化費時費力;故探究快速監(jiān)測魚肉品質變化的方法具有較高的實用價值和經濟意義。

    水分是決定水產品微生物生長和腐敗的主要因素之一,低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)技術檢測水分具有快速無損的技術特點,適合對加工貯藏過程中不同階段的水產品進行水分含量和狀態(tài)的監(jiān)測,結合化學計量學模型,能快速反映魚肉的品質變化[2]。暗紋東方鲀作為一種高蛋白魚類,其肌肉的蛋白質量分數高達18.44%,蛋白質變化是魚肉營養(yǎng)素流失和質地變化的重要原因[3]。Wang Shuo等[4]分析了蛋白質和水分的變化規(guī)律,發(fā)現能通過監(jiān)測水分和蛋白質的變化來快速監(jiān)測冷藏期間金槍魚的品質變化。此外,質地是反映魚肉組織結構的重要指標之一,有研究發(fā)現魚肉的質地和水分含量顯著相關,朱丹實等[5]發(fā)現冷藏(4 ℃)條件下鯉魚的結合水含量對彈性影響較大,Lu Han等[6]認為微凍(-3 ℃)條件下蛋白質的變化對鳙魚的彈性、硬度和水分損失(離心損失和汁液損失)有顯著影響。目前有關利用LF-NMR技術快速監(jiān)測暗紋東方鲀品質變化的研究較少。

    本研究的主要目的是探究低溫貯藏(10、4 ℃和-3 ℃)期間暗紋東方鲀的水分、質地以及蛋白質的變化規(guī)律,此外,研究水分的橫向弛豫時間和蛋白質、質地變化之間的關系,為進一步開發(fā)從水分變化角度分析和監(jiān)測低溫貯藏下暗紋東方鲀品質變化的快速方法提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    暗紋東方鲀購于江蘇省中洋集團股份有限公司,體長25~32 cm、體質量0.25~0.30 kg。

    硫酸銅、氯化鉀、三氯乙酸、2-硝基苯甲酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、二硝基苯肼、甲醇、鹽酸胍、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 上海生工生物工程有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、考馬斯亮藍R-250上海安譜實驗科技有限公司。其中甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉為色譜純,其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    MesoMR23-060H.I LF-NMR儀 上海紐邁電子科技有限公司;TA-XT Plus質構儀 英國SMS公司;WFZ UV-2100紫外-可見分光光度計 日本尤尼柯儀器有限公司;L-8800全自動氨基酸分析儀、S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司;BOC Edwards Lyofast真空冷凍干燥機北京天利聯合科技有限公司;Nicolet傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)儀美國賽默飛世爾公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品預處理

    新鮮的暗紋東方鲀宰殺后立即去皮、眼睛和內臟,直接將整條魚裝入聚乙烯拉鏈袋(35 cm×14 cm)后,分別貯藏于10、4 ℃和-3 ℃(前期研究表明暗紋東方鲀的凍結點為-1.121 ℃[7])的恒溫恒濕箱(相對濕度90%~95%)中,每隔2 d取樣進行指標測定。

    1.3.2 肌原纖維蛋白的提取和含量測定

    參考Lü Mingchun等[8]的方法提取肌原纖維蛋白。準確稱取2 g絞碎的魚肉于50 mL離心管中,加入10 倍體積緩沖液A(含20 mmol/L Tris-馬來酸、0.05 mol/L KCl,pH 7.0),4 ℃下勻漿。勻漿液在4 ℃以10 000 r/min離心15 min,上清液為水溶性蛋白(water soluble protein,WSP)。取沉淀物加入10 倍體積緩沖液B(含20 mmol/L Tris-馬來酸、0.6 mol/L KCl,pH 7.0)勻漿,勻漿液4 ℃下浸提1 h,浸提后的勻漿液為鹽溶性蛋白(salt soluble protein,SOP),勻漿液10 000 r/min、4 ℃下離心15 min,上清液即為肌原纖維蛋白溶液。根據雙縮脲法測定肌原纖維蛋白溶液的蛋白質量濃度,以牛血清白蛋白作為標準溶液。

    1.3.3 水分相關指標分析

    1.3.3.1 水分分布測定

    參考Wang Xinyun等[2]的方法進行LF-NMR和核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)分析。取背部肌肉切成魚塊(2.0 cm×2.0 cm×3.0 cm)測定,迭代反演后得到橫向弛豫時間T2圖譜,采用LF-NMR儀對魚塊進行成像,得到質子密度圖后進行映射和偽彩分析。

    1.3.3.2 蒸煮損失率、離心損失率和汁液損失率測定

    蒸煮損失率參考Hong Hui等[9]的方法測定。取背部肌肉(1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm)稱質量(mb/g),放入拉鏈袋后于85 ℃蒸煮15 min,冷卻5 min后重新稱樣品質量(mc/g)。蒸煮損失率的計算見公式(1)。

    汁液損失率參考Robinson等[10]的方法測定,測定貯藏前后的質量,分別記為mo/g和mi/g,汁液損失率按公式(2)計算。

    離心損失率參考Wang Xinyun等[2]的方法測定,準確量取5 g背部肌肉(mf/g),用雙層濾紙包裹后置于50 mL離心管中,3 000 r/min離心10 min,重新稱量沉淀后的質量(mp/g)。離心損失率按公式(3)計算。

    1.3.4 微觀組織結構觀察

    參考Lu Han等[6]的方法,將背部肌肉切成立方體(1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm),通過掃描電子顯微鏡對魚塊的縱切面進行掃描觀察。

    1.3.5 質構特性測定

    參考朱丹實等[5]的方法測定魚肉的質構特性(硬度和彈性),通過質構儀對樣品的背部肌肉(3.0 mm×3.0 mm×3.0 mm)進行測定。主要參數如下:測試前速率4.00 mm/s、測試速率1 mm/s、測試后速率5 mm/s、應變(樣品壓縮幅度)60%、初始距離5.0 cm、測試力5.0 g。

    1.3.6 總巰基、二硫鍵、總羰基含量,Ca2+-ATPase活力和游離氨基酸含量測定

    總巰基和二硫鍵含量的測定:取0.5 mL 4 mg/mL肌原纖維蛋白溶液加到4.5 mL緩沖液I(總巰基:含8 mol/L尿素、3 mmol/L EDTA、1%(質量分數,下同)SDS、0.2 mol/L Tris-HCl;二硫鍵:含8 mol/L尿素、3 mmol/L EDTA、1% SDS、0.1 mol/L Na2SO3、0.2 mol/L Tris-HCl)中,充分混勻,取4 mL混合液,加入0.5 mL緩沖液II(總巰基:含10 mmol/L二硝基苯甲酸、0.2 mol/L Tris-HCl;二硫鍵:含8 mol/L尿素、3 mmol/L EDTA、1% SDS、0.1 mol/L Na2SO3、10 mL/L NTSB、0.2 mol/L Tris-HCl),40 ℃溫育25 min,在412 nm波長處測定吸光度??瞻捉M用0.6 mol/L NaCl溶液代替樣品。

    其中NTSB溶液的制備:將100 mg二硝基苯甲酸溶解到10 mL 1 mol/L的亞硫酸鈉溶液中,38 ℃通入氧氣,溶液由亮紅色變?yōu)榈S色,即表示NTSB生成。巰基和二硫鍵含量均按公式(4)進行計算,結果以蛋白質量計。

    式中:A表示吸光度;ρ表示蛋白質量濃度/(mg/mL);ε表示摩爾吸光系數,為13 600 L/(mol·cm);d表示稀釋倍數,為10.00。

    總羰基含量參考張晗等[12]的方法測定,以摩爾吸光系數22 000 L/(mol·cm)計算暗紋東方鲀蛋白羰基含量,單位為nmol/mg,結果以蛋白質量計。

    Ca2+-ATPase活力參考Lu Han等[6]的方法測定,結果表示為1 min內1 mg蛋白催化ATP生成無機磷的量,單位為μmol/(mg·min)。

    游離氨基酸含量參考Sun Xinyun等[13]的方法,準確稱取2 g絞碎的魚肉,使用全自動氨基酸分析儀測定。

    1.3.7 肌原纖維蛋白結構測定

    1.3.7.1 二級結構測定

    取2 mL 4 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液冷凍干燥48 h,稱量0.5 g干燥后的樣品置于FTIR儀,在25 ℃下掃描整個條帶,儀器分辨率為4 cm-1,每個樣品以空氣為背景進行掃描。用Omnic 9.2.106光譜軟件處理原始數據,用PeckFit v4.12光譜分析擬合軟件對譜峰進行擬合。

    1.3.7.2 三級結構測定

    肌原纖維蛋白樣品被0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7)稀釋為0.4 mg/mL,用于后續(xù)測定。熒光分光光度計參數設定:激發(fā)波長295 nm,波長范圍為310~400 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

    1.4 數據處理與分析

    所有指標測定均設3 個平行,并用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析(方差分析和鄧肯氏檢驗),采用Origin 9.0軟件繪圖。

    2 結果與分析

    2.1 暗紋東方鲀魚肉在不同溫度貯藏過程中的水分變化情況

    2.1.1 LF-NMR分析結果

    圖1 低溫貯藏下暗紋東方鲀不同狀態(tài)水分弛豫時間、峰面積比例的變化Fig. 1 Changes in transverse relaxation time and peak area fraction of each water component in Takifugu rubripes under low temperature storage

    通過LF-NMR測定的橫向弛豫時間T2可以區(qū)分不同水分在魚肉中的分布[14],T2反映各水分與魚肉結合程度,T2越小,結合程度越緊密。弛豫圖譜的3 個峰分別代表與蛋白質大分子緊密相關的結合水(T2b,1.35~6.93 ms)、肌膜與肌纖維之間的不易流動水(T21,49.33~88.67 ms)及肌原纖維外部的自由水(T22,427.00~799.67 ms)。各組T2b隨貯藏時間延長呈上升趨勢,可能是在酶和微生物的作用下蛋白質發(fā)生降解,使結合水流動性增加,結合程度降低(圖1A)。貯藏前期冰晶的形成(-3 ℃)或環(huán)境溫度的驟降均可能導致流動性較大的水分流向肌膜外,自身水分的遷移會導致不易流動水的自由度降低,因此T21降低;貯藏后期蛋白酶的作用導致肌原纖維蛋白結構被大量破壞,不易流動水和肌原纖維的結合程度下降[15],故T21隨貯藏時間的延長呈先下降后上升交替波動的變化趨勢(圖1B)。T22呈波動上升的趨勢,且貯藏溫度越高,蛋白質等物質的降解速度越快,自由水的流動性越大(圖1C)。

    圖譜的峰面積可表征各水分的相對含量(圖1D)。各組結合水的相對含量(P2b)呈波動上升的趨勢。不易流動水和自由水分別處于肌肉纖維膜的內外部,前期肌肉內發(fā)生無氧代謝等化學反應,導致膜通透性的增加,膜外水流入內部,不易流動水和自由水的相對含量(P21和P22)分別出現短暫的增加和減少,中后期魚肉的自溶作用加強,膜內蛋白質水解,導致膜內水外流,P21和P22分別減少和增加,低溫貯藏下魚肉內的不易流動水和自由水可能相互轉化[16]。-3 ℃組在貯藏末期的P22下降明顯,貯藏至14 d的水分相對含量為0.649%,24 d下降至0.09%,可能是由于肌原纖維外部水形成冰晶導致自由水流失嚴重[5]。

    2.1.2 MRI成像結果

    通過MRI圖可以觀察暗紋東方鲀內部組織形態(tài)和水分子分布狀況(圖2)。在MRI圖像中,黃色和藍色分別對應高質子和低質子密度區(qū)域,各組的顏色和亮度隨貯藏時間延長從亮黃色向綠藍色變化,表明魚肉中P21整體呈下降趨勢,MRI成像結果與LF-NMR分析結果基本一致。

    圖2 低溫貯藏下暗紋東方鲀核磁共振成像的變化Fig. 2 Changes in magnetic resonance image of Takifugu rubripes under low temperature storage

    2.1.3 蒸煮損失率、汁液損失率和離心損失率

    如圖3A、B所示,暗紋東方鲀蒸煮損失率和離心損失率隨低溫貯藏時間延長總體呈上升趨勢,且溫度越高,水分損失越大。如圖3C所示,各組的汁液損失率隨貯藏時間延長顯著上升(P<0.05),可能是肌原纖維蛋白的降解會破壞肌肉纖維結構,導致水分和水溶性成分(如肌漿蛋白)大量損失;此外,微凍(-3 ℃)組的汁液損失率明顯高于其他貯藏組,從貯藏第2天開始,10 ℃和4 ℃組的變化范圍分別為1.34%~3.27%和0.14%~2.71%,而-3 ℃組為0.73%~17.71%,雖然低溫能減緩蛋白質的降解和氧化,但是微凍條件下形成的冰晶融化后部分水不能遷移回組織,同時攜帶部分可溶性蛋白質,導致汁液損失嚴重[17-18]。

    圖3 低溫貯藏下暗紋東方鲀蒸煮損失率(A)、離心損失率(B)和汁液損失率(C)的變化Fig. 3 Changes in cooking loss rate (A), centrifugal loss rate (B) and drip loss rate (C) of Takifugu rubripes under low temperature storage

    2.2 暗紋東方鲀魚肉在不同溫度貯藏過程中的質地變化情況

    質構參數是衡量魚肉組織結構的重要指標。如表1所示,各組的彈性和硬度隨貯藏時間延長呈下降的趨勢,表1中的r表征不同貯藏溫度下魚肉的硬度或彈性和貯藏時間的相關性,r的絕對值越接近于1.000,說明該貯藏溫度下貯藏時間對魚肉硬度或彈性的影響越大。彈性與時間的相關系數在10 ℃組中最大,說明3 個溫度中,10 ℃下的彈性與貯藏時間的相關性最高。此外,不同貯藏溫度下魚肉的硬度指標均與貯藏時間顯著相關,說明貯藏時間對魚肉硬度影響較大。

    表1 低溫貯藏下暗紋東方鲀質構參數的變化Table 1 Changes in TPA parameters of Takifugu rubripes under low temperature storage

    圖4是新鮮魚肉(0 d)和各組魚肉在第12天的縱切面微觀組織結構情況,新鮮魚肉(0 d)的肌纖維結構緊密且輪廓清晰,在貯藏的第12天,10 ℃和4 ℃組魚肉的肌纖維受到擠壓發(fā)生扭曲變形。-3 ℃組肌纖維結構較完整,但內部出現明顯裂口損傷。因此,低溫有助于維持肌肉組織結構的完整度,但微凍下的冰晶會導致肌纖維受到機械損傷,甚至斷裂,影響魚肉質地。

    圖4 低溫貯藏過程中暗紋東方鲀肌肉微觀組織結構的變化Fig. 4 Changes in muscle microstructure of Takifugu rubripes under low temperature storage

    2.3 暗紋東方鲀魚肉在不同溫度貯藏過程中的蛋白質變化情況

    2.3.1 SOP、WSP含量

    SOP主要由肌原纖維蛋白(肌球蛋白、肌動蛋白等)組成,WSP主要由肌漿蛋白等組成。如圖5A、B所示,新鮮魚肉的SOP和WSP含量分別為101.17 mg/g和40.37 mg/g,隨著貯藏時間的延長,各組的SOP含量呈下降趨勢,一方面,主要是酶和微生物的作用導致肌原纖維蛋白降解,導致SOP含量降低;此外,貯藏過程中巰基會氧化為二硫鍵,易引起肌球蛋白重鏈的聚合[19],也會導致SOP含量降低。而魚肉中的WSP含量的上升可能是由于肌原纖維蛋白降解成了一些溶于水的小分子蛋白。

    圖5 低溫貯藏下暗紋東方鲀SOP(A)和WSP(B)含量的變化Fig. 5 Changes in salt-soluble (A) and water-soluble (B) protein content in Takifugu rubripes under low temperature storage

    2.3.2 總巰基及二硫鍵含量

    圖6 低溫貯藏下暗紋東方鲀總巰基(A)和二硫鍵(B)含量的變化Fig. 6 Changes in total sulfhydryl group (A) and disulfide bond (B)contents in Takifugu rubripes under low temperature storage

    如圖6A所示,魚肉總巰基含量隨貯藏時間延長呈顯著下降的趨勢,且貯藏溫度越高,下降越快,10、4 ℃和-3 ℃組貯藏至12 d分別下降了59.38%、44.51%和33.41%,-3 ℃組貯藏26 d僅下降了50.78%。原因是半胱氨酸殘基中的巰基易氧化成二硫鍵,且溫度越高,氧化速度越快,周果等[11]研究發(fā)現4 ℃比-3 ℃條件下貯藏的金槍魚肉更易氧化,此外,貯藏溫度越高,位于肌球蛋白內部巰基的越容易暴露,也會加快巰基的氧化速度。如圖6B所示,魚肉二硫鍵含量總體上隨貯藏時間延長呈上升的趨勢,-3 ℃貯藏組魚肉的二硫鍵含量在貯藏至22 d時發(fā)生短暫的下降,是因為蛋白質在氧化應激過程中,二硫鍵可能會轉化為其他物質;此外,氧化過程中形成的無效中間體會引起二硫鍵外露,導致二硫鍵易被其他物質還原或重排,也會導致其含量下降[20]。

    圖7 低溫貯藏下暗紋東方鲀Ca2+-ATPase活力的變化Fig. 7 Changes in Ca2+-ATPase activity of Takifugu rubripes under low temperature storage

    2.3.3 Ca2+-ATPase活力

    肌球蛋白約占肌原纖維蛋白含量的6 0%,Ca2+-ATPase活力是表征肌球蛋白完整性的指標,其越高,表明蛋白質變性程度越小[12]。如圖7所示,新鮮魚肉的Ca2+-ATPase活力為0.54 μmol/(mg·min),10、4 ℃和-3 ℃組魚肉貯藏至12 d時分別下降了59.26%、44.44%和29.63%,各組的Ca2+-ATPase活力隨貯藏時間延長而降低,且溫度越高,下降越快。肌球蛋白的交聯和其頭部構象的改變可能是導致Ca2+-ATPase活性下降的主要因素[21];有報道稱部分巰基的氧化也會影響Ca2+-ATPase活力[19]。

    2.3.4 羰基含量

    圖8 低溫貯藏下暗紋東方鲀羰基含量的變化Fig. 8 Changes in protein carbonyl content in Takifugu rubripes under low temperature storage

    羰基含量是表征肌原纖維蛋白氧化程度的重要指標之一。如圖8所示,-3、4 ℃和10 ℃組羰基含量總體呈上升趨勢,一方面是因為氧化應激過程的部分氨基酸殘基受到自由基的攻擊,導致殘基上的氨基(—NH2)或亞氨基(—NH)轉化為醛基;另一方面,活性氧引起蛋白主肽鏈的斷裂可能也會導致羰基含量增加[9]。新鮮魚肉的羰基含量為0.88 nmol/mg,相同的貯藏時間內,各組的羰基含量變化無明顯差異。-3 ℃組在貯藏前20 d的羰基含量呈上升趨勢,但從20 d貯藏至26 d羰基含量下降了14%,是因為蛋白質羰基化具有一定的特異選擇性[22],可能低溫影響了羰基化的比例,且一旦部分羰基化蛋白質不能被降解,則易于和細胞內其他氧化物質交聯生成新的高聚物[22],導致貯藏后期羰基的降解和轉化速率快于生成速率,因此其含量下降。

    2.3.5 游離氨基酸含量

    游離氨基酸是蛋白質降解的產物,其含量變化能反映蛋白質的降解[13]。如表2所示,各組的游離氨基酸總含量隨貯藏時間總體呈上升的趨勢,可能蛋白水解酶和微生物引起蛋白質的降解,10 ℃和4 ℃組的樣品貯藏至12 d時游離氨基酸的總含量分別增加了125.3%和50.39%,-3 ℃組在0~12 d的游離氨基酸總含量無明顯變化,陳桂平[24]發(fā)現游離氨基酸的釋放主要取決于易受溫度影響的外肽酶(肽酶、氨肽酶和羧肽酶等)的活性,由于低溫抑制了酶和微生物的活性,導致蛋白質的降解速率降低,因此-3 ℃組魚肉游離氨基酸含量變化最小。甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸和精氨酸是暗紋東方鲀魚肉中主要的游離氨基酸成分,占總含量的一半以上,其中,各組的賴氨酸和精氨酸含量呈先下降后上升的趨勢,可能是帶正電的賴氨酸(pI 9.74)和精氨酸(pI 10.76)同暗紋東方鲀蛋白質表面的負電荷的中和導致其含量的下降[24];此外,微生物的生成代謝會消耗部分游離氨基酸,也可能會導致其含量降低[20]。

    2.3.6 肌原纖維蛋白二級結構

    圖9 A 為低溫貯藏期間的魚肉肌原纖維蛋白在4 0 0 0 ~5 5 0 c m-1范 圍 內 的F T I R 圖 。 酰 胺I 帶(1 700~1 600 cm-1)是目前應用最普遍的蛋白質譜帶,其吸收峰通過表征C=O的伸縮振動頻次反映肽鏈構象變化情況,新鮮魚樣的吸收峰波數為1 642 cm-1,貯藏期間樣品的肌原纖維蛋白吸收峰的移動可能是多肽鏈構象的變化所致,各溫度組紅外光譜圖無明顯差異。對酰胺I帶進行去卷積化定量分析,得到二級結構相對含量變化(圖9B~D)。新鮮魚樣包含24.53%的α-螺旋、38.24%的β-折疊、16.32%的β-轉角和20.71%的無規(guī)卷曲,貯藏前期(前6 d),各組的α-螺旋和無規(guī)卷曲相對含量變化不明顯,主要是β-轉角和β-折疊之間相互轉化,巰基氧化為二硫鍵可能會引起β-轉角和β-折疊等蛋白質結構之間的轉化[25]??傮w來說,各組的α-螺旋和β-折疊相對含量隨貯藏時間延長分別呈波動下降和上升的趨勢,維系肌原纖維蛋白二級肽鏈結構的氫鍵等被大量破壞,導致肌原纖維蛋白螺旋結構的部分解折疊,α-螺旋含量減少[26]。

    表2 低溫貯藏下暗紋東方鲀游離氨基酸含量的變化Table 2 Changes in FAA contents in Takifugu rubripes under low temperature storage

    圖9 低溫貯藏下暗紋東方鲀肌原纖維蛋白二級結構相對含量的變化Fig. 9 Changes in secondary structure relative contents of myofibrillar protein in Takifugu rubripes under low temperature storage

    2.3.7 肌原纖維蛋白三級結構

    內源熒光光譜是探索蛋白質構象變化的重要方法之一。如圖10所示,新鮮魚樣的熒光強度最高,發(fā)射波長為336 nm處的熒光強度最大,熒光量子產率對色氨酸殘基(tryptophan residues,TR)周圍的微環(huán)境變化非常敏感,貯藏初期TR大部分被包裹在肌原纖維蛋白內部,肌原纖維蛋白熒光強度較高。在氧化應激過程中,肌原纖維蛋白內源熒光強度降低,可能是因為維系肌原纖維蛋白三級結構的次級鍵斷裂,其結構從折疊和盤繞向展開狀態(tài)轉化,導致TR等熒光基團易暴露在極性環(huán)境中[27];此外,鄭紅[28]認為冷藏(4 ℃)下的鱔魚蛋白質二級結構的變化可能對TR的微環(huán)境也有較大影響。10、4 ℃和-3 ℃組貯藏至12 d最大發(fā)射波長的熒光強度分別下降了60.06%、41.27%和23.82%,而-3 ℃組貯藏至26 d才下降了42.41%,說明貯藏溫度對肌原纖維蛋白熒光強度影響很大。

    圖10 低溫貯藏下暗紋東方鲀肌原纖維蛋白內源熒光光譜的變化Fig. 10 Changes in intrinsic fluorescence intensity of myofibrillar protein in Takifugu rubripes under low temperature storage

    2.4 相關性分析結果

    表3 低溫貯藏下暗紋東方鲀弛豫時間和品質指標的相關性Table 3 Correlation between relaxation times and quality indicators of Takifugu rubripes under low temperature storage

    如表3所示,不同溫度貯藏組T21和蛋白質、質地參數無顯著相關性(P>0.05)。T2b、T22和離心損失率、汁液損失率、WSP含量、二硫鍵含量、β-折疊相對含量、總FAA含量、彈性、SOP含量、巰基含量、Ca2+-ATPase活力以及肌原纖維蛋白熒光強度顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)相關,其中,10、4、-3 ℃條件下魚肉的T2b、T22與Ca2+-ATPase活力的相關性系數分別是-0.975、-0.980,-0.967、-0.957,-0.980、-0.897。綜上所述,相關性分析顯示暗紋東方鲀的蛋白質、質地變化與弛豫時間(T2b和T22)有關,可以在低溫貯藏過程中通過LF-NMR監(jiān)測魚肉的品質變化。

    3 結 論

    根據LF-NMR結構分析,貯藏溫度對魚肉的弛豫時間(T2b、T21和T22)影響較大。隨貯藏時間延長,10、4 ℃和-3 ℃組魚肉水分損失(蒸煮、離心和汁液損失)呈上升趨勢,而魚肉的彈性和硬度總體上均呈下降趨勢;WSP、二硫鍵、羰基和總游離氨基酸含量呈上升趨勢,而SOP、總巰基含量和Ca2+-ATPase活力呈下降趨勢,表明蛋白質在低溫貯藏過程發(fā)生了降解和氧化。內源性熒光光譜顯示肌原纖維蛋白熒光強度隨貯藏時間延長逐漸降低,而紅外光譜結果表明α-螺旋和β-折疊相對含量分別呈波動下降和上升趨勢,說明肌原纖維蛋白的二級和三級結構均發(fā)生變化。結合蛋白質相關指標測定結果和掃描電子顯微鏡觀察結果可以得出,雖然低溫有助于抑制蛋白質的降解和氧化,但是微凍條件下的冰晶會影響魚肉的質地。由相關性分析結果可知,魚肉在貯藏過程中的蛋白質和質地參數與T2b、T22呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)相關,因此通過檢測橫向弛豫時間可快速無損監(jiān)測低溫貯藏期間暗紋東方鲀的品質變化。

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