白蛋白結(jié)合紫杉醇腹腔灌注化療的動物實驗

葉 穎 蔣 華

作者單位：南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院213000

腹膜癌是腹腔內(nèi)腫瘤晚期患者比較常見的情況，患者一旦出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移并發(fā)惡性腹水，是癌癥終末期表現(xiàn)，預(yù)后極差，患者的生存期通常都不超過1年［1～3］，常規(guī)治療主要通過反復(fù)腹腔穿刺引流以及藥物灌注等，但效果不理想，不僅引起腹水增長過快，還進一步造成低蛋白血癥、水電解質(zhì)紊亂等情況，惡性腹腔積液的控制是腫瘤科的難題之一。另一方面，隨著研究的深入，國際上對腹膜癌的認知也出現(xiàn)了轉(zhuǎn)變，并非所有的腹膜癌均為癌癥廣泛轉(zhuǎn)移的結(jié)果，有一部分患者為區(qū)域性癌轉(zhuǎn)移，對于這些患者加強腹腔局部控制能夠帶來更長的生存期［4］。

在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌是導(dǎo)致死亡的主要原因，其發(fā)病率僅次于宮頸癌［5］，且卵巢癌患者在腹腔灌注整個治療體系中所占比例很大。卵巢癌早期無明顯臨床癥狀，在診斷時通常已處在晚期，卵巢癌對化療敏感，鉑類聯(lián)合紫杉醇是卵巢上皮癌的一線化療方案［6］。種植轉(zhuǎn)移是最重要的轉(zhuǎn)移途徑，當腫瘤細胞穿透包膜時，可以廣泛種植在盆腔和腹腔中，形成腹膜癌（PC）并且合并惡性腹水，在這種情況下患者的中位生存時間僅為12 ～24 月［7］，五年生存率不到20%［8］，因此卵巢癌患者腹膜癌的治療對于改善預(yù)后、延長生存期有重要意義。美國婦科腫瘤協(xié)作組2006年在新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊發(fā)表的Ⅲ期臨床研究GOG172的結(jié)果顯示［6］，相比靜脈TP（紫杉醇聯(lián)合順鉑）方案，腹腔注射（Intraperitoneal，IP）組無進展生存期（PFS）提高了5個月（18.3月vs.23.8月，P＝0.05），總生存期提高了近16個月（49.7月vs.65.6月，P＝0.03），這個結(jié)果引起了臨床專家的關(guān)注，隨后開展了一系列有關(guān)卵巢癌腹腔灌注化療的相關(guān)研究。隨著腹腔灌注技術(shù)的發(fā)展，腹腔熱灌注化療（HIPEC）逐漸運用于臨床惡性腹水的治療，HIPEC在復(fù)發(fā)性卵巢癌中的研究目前僅限于單一機構(gòu)的經(jīng)驗和回顧性研究，盡管多數(shù)研究結(jié)果都支持HIPEC，但是缺少大型前瞻性Ⅲ期臨床研究結(jié)果支撐［9］。

目前腹腔局部治療主要集中在藥物治療和HIPEC上，盡管研究很多，但是還是存在很多問題，例如：新型納米紫杉藥物在很多腫瘤治療中已經(jīng)被證明比傳統(tǒng)紫杉醇和多西紫杉醇療效更好，那么在腹腔內(nèi)用藥是否也更優(yōu)？已有研究表明一種摻入了紫杉醇的聚合物膠束納米顆粒NK105在腹腔內(nèi)使用時，與IP紫杉醇相比具有明顯更大的抗腫瘤作用［10］，那么臨床應(yīng)用更廣泛的納米白蛋白紫杉醇是否也同樣更好？近年來抗血管生成藥物在臨床應(yīng)用越來越多，有研究證明這類藥同樣對胸腹水的控制有良好效果，與化療藥聯(lián)合應(yīng)用能否更好地局部控制也是令人感興趣的話題。本研究主要在動物實驗中探索了不同紫杉類藥物腹腔內(nèi)灌注的療效區(qū)別，以及與抗血管生成藥物聯(lián)合應(yīng)用結(jié)果。

1.材料和方法

1.1 實驗材料 裸鼠70只雌性BALB／c裸鼠，體重18～22g，4～5周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2017-0006，合格證編號：2015000561673；實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2017-0015。根據(jù)實驗動物護理指南維護并照顧所有動物，飼養(yǎng)于裸鼠專用塑料籠中，并置于隔離房內(nèi)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為26℃，濕度為70%，每天光照12小時。細胞系：ES-2系（人卵巢癌細胞）購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，將細胞培養(yǎng)在含有10%FBS［Biological Industries（BI）胎牛血清購于北京沃比森科技有限公司］和青霉素／鏈霉素的McCoy's 5A培養(yǎng)基中，并于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期傳代細胞以維持指數(shù)生長?；熕幬铮喉樸K購自齊魯制藥有限公司，紫杉醇購自長江制藥集團，白蛋白紫杉醇購自恒瑞醫(yī)藥有限公司，安維汀購自上海羅氏制藥有限公司，恩度購于先聲藥業(yè)，所有藥物均于4℃保存，加入生理鹽水中調(diào)配置實驗所需的藥物濃度。無菌條件下向所有裸鼠腹腔內(nèi)注射0.2ml含有2×106個的ES-2細胞的PBS細胞懸液，接種后觀察腹部膨脹程度，注射后約8天裸鼠出現(xiàn)腹部鼓脹，B超檢查可見液體暗區(qū)，這意味著腹水形成，卵巢癌裸鼠腹水模型構(gòu)建成功。

1.2 實驗設(shè)計 接種24小時后，將裸鼠隨機分成7組，除空白對照組外，其余實驗組裸鼠分別在種瘤后的第8天、11天和14天注射實驗藥物。分組和劑量如下：空白組（Blank）正常喂養(yǎng)，未經(jīng)任何處理；生理鹽水對照組（Control）注射化療組相同體積的生理鹽水（NS）；順鉑組（DDP）注射順鉑（10mg／kg）；紫杉醇組（PTX）注射紫杉醇（10mg／kg）；白蛋白紫杉醇組（Nab-PTX）注射白蛋白紫杉醇（10mg／kg）；白紫＋安維汀組（NP＋Ava）注射白蛋白紫杉醇（10mg／kg）＋ 安維汀（5mg／kg）；白紫＋恩度組（NP ＋Endo）注射白蛋白紫杉醇（10mg／kg）＋恩度（5mg／kg）。實驗期間正常喂養(yǎng)所有裸鼠。觀察指標：①每天測量裸鼠腹圍、體重。②觀察裸鼠的一般情況，如進食和腹瀉等。③給藥前和全部給藥結(jié)束后（第15天）抽取裸鼠尾靜脈血行血常規(guī)檢測。④記錄所有裸鼠死亡情況，實驗期間裸鼠正常喂養(yǎng)直至自然死亡，觀察腹水的顏色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計結(jié)果表示為平均值，所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 23.0進行，用t檢驗比較兩組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。三組或更多組的變量通過單因素方差分析比較。P＜0.05時認為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 裸鼠腹水控制情況 實驗中由于第8天起裸鼠腹水明顯增多，所以選擇第8天進行第一次腹腔注射化療藥物。（1）單藥組（順鉑組、紫杉醇組、白蛋白紫杉醇組）：①第一次腹腔灌注后（第9天）：所有實驗組裸鼠腹圍增加緩慢，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P9th＜0.05），各實驗組之間腹圍差異均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），可見所有化療藥物均可抑制腹水增長。②第二次腹腔灌注后（第12天）：白蛋白紫杉醇組裸鼠腹圍明顯低于順鉑組和紫杉醇組（P＝0.012，P＝0.007）。③第三次腹腔注射后（第15天）：裸鼠腹圍達到最低點，白蛋白紫杉醇組與順鉑、紫杉醇組的差異持續(xù)存在并有統(tǒng)計學(xué)意義，白蛋白紫杉醇組對腹水控制效果更佳且持續(xù)時間更長。（2）聯(lián)合用藥組（白蛋白紫杉醇＋安維汀，白蛋白紫杉醇＋恩度）：①第一次腹腔灌注后（第9天）：與各單藥組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。②第二次腹腔灌注后（第12天）：與單藥順鉑組、紫杉醇組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），與單藥白蛋白紫杉醇、以及兩組聯(lián)合用藥中尚未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。③第三次腹腔注射后（第15天）：白蛋白紫杉醇＋安維汀比單藥白紫組對腹水的抑制效果更強（P＜0.01），白蛋白紫杉醇＋恩度與單藥白紫組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可見白蛋白紫杉醇聯(lián)合安維汀對腹水的抑制程度更優(yōu)于單藥白蛋白紫杉醇組，而白蛋白紫杉醇聯(lián)合恩度對腹水的控制情況較單藥白紫無明顯優(yōu)勢。見圖1。

圖1 所有裸鼠在25天內(nèi)的腹圍均值的變化

圖2 所有裸鼠在25天內(nèi)體重均值的變化

2.2 裸鼠體重變化情況 裸鼠體重變化與腹圍變化相對一致，體重可從另一側(cè)面反映藥物對裸鼠腹水的抑制情況。（1）單藥組（順鉑組、紫杉醇組、白蛋白紫杉醇組）：①第一次腹腔灌注后（第9天）：所有實驗組裸鼠體重增加緩慢，各實驗組之間無差異（P＞0.05）。②第二次腹腔灌注后（第12天）：白蛋白紫杉醇組裸鼠體重低于順鉑組和紫杉醇組（P＜0.01）。③第三次腹腔注射后（第15天）：各組裸鼠體重達到最低點，白蛋白紫杉醇組與順鉑、紫杉醇組的差異持續(xù)存在并有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）聯(lián)合用藥組（白蛋白紫杉醇＋安維汀，白蛋白紫杉醇＋恩度）：①第一次腹腔灌注后（第9天）：各組之間尚未出現(xiàn)差異。②第二次腹腔灌注后（第12天）：與單藥白蛋白紫杉醇組、白蛋白紫杉醇＋恩度聯(lián)合組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。③第三次腹腔注射后（第15天）：白蛋白紫杉醇＋安維汀組體重抑制最為明顯，與聯(lián)合恩度組及單藥白紫組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.02，P＝0.03），且低于空白組。由于體重可能受到化療藥物的毒副反應(yīng)、腫瘤消耗的影響，不能完全認為是藥物療效，還需進一步評估聯(lián)合用藥是否增加不良反應(yīng)。見圖2。

2.3 裸鼠生存時間分析 實驗期間所有裸鼠均正常喂養(yǎng)，直至自然死亡，記錄每只裸鼠的存活時間（見表1）。裸鼠死亡時解剖發(fā)現(xiàn)腹水均為淡黃色。

2.4 各組裸鼠生存曲線分析 （1）單藥組（圖3A、B、C）：與對照組、順鉑和紫杉醇組相比，白蛋白紫杉醇可以延長腹水控制時間（PA＝0.00，PB＝0.012，PC＝0.014），這意味著白蛋白紫杉醇可有效控制腹水并延長卵巢癌裸鼠的壽命。（2）聯(lián)合用藥組（圖3D、E）結(jié)果顯示白蛋白紫杉醇聯(lián)合抗血管生成藥物較對照組來說，可延長裸鼠的存活時間，但與單藥白蛋白紫杉醇相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（PE＝0.078），可認為相比單藥白蛋白紫杉醇，聯(lián)合抗血管生成藥物并沒有更加延長裸鼠存活時間的優(yōu)勢，而在聯(lián)合恩度組中裸鼠總生存時間較單藥白紫有縮短的趨勢，聯(lián)合用藥可能會增加藥物毒副反應(yīng)從而造成裸鼠生存時間變短，這需要進一步對藥物劑量的選擇進行摸索。

表1 所有裸鼠總存活時間 單位：天

圖3 各組裸鼠生存曲線比較

2.5 藥物不良反應(yīng) 在藥物灌注前以及藥物灌注后分別抽取裸鼠尾靜脈血2次，分別進行血常規(guī)檢測，通過觀察白細胞、血紅蛋白、血小板的抑制程度評估每種實驗藥物的骨髓抑制情況。結(jié)果顯示，各組化療藥物均可造成裸鼠的白細胞、血紅蛋白和血小板下降，但各組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這意味著各化療單藥及聯(lián)合用藥在裸鼠骨髓的造血細胞中骨髓抑制作用相似，暫無加重骨髓抑制程度的證據(jù)，見表2。

3.結(jié)論

在腹腔灌注單藥對比中，證實腹腔注射白蛋白紫杉醇是抑制晚期卵巢惡性腹水的有效策略，局部腹水控制時間和總生存時間優(yōu)于順鉑或紫杉醇。副作用方面，順鉑、紫杉醇和白蛋白紫杉醇三組實驗組的骨髓抑制程度相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可認為腹腔灌注白蛋白紫杉醇相比順鉑和紫杉醇并未增加局部化療的不良反應(yīng)。白蛋白紫杉醇聯(lián)合安維汀與單藥白蛋白紫杉醇相比，能夠更加有效地控制腹水，有延長裸鼠總生存時間的趨勢。

表2 給藥前后裸鼠白細胞、血紅蛋白、血小板的平均值變化

該結(jié)果為腹腔灌注白蛋白紫杉醇腹腔灌注治療卵巢癌腹水奠定了基礎(chǔ)，這是首次腹腔內(nèi)使用單藥白蛋白紫杉醇治療的實驗研究，對白蛋白結(jié)合型紫杉醇運用于臨床HIPEC，為卵巢癌腹水患者提供了更多腹腔灌注的藥物選擇有重要的臨床意義。必須進行更多的動物研究和臨床試驗，以提高卵巢癌患者腹水治療的有效性和安全性。

4.討論

卵巢癌患者即使在行滿意的細胞滅減術(shù)（CRS）之后仍可能在腹腔內(nèi)殘留大量游離癌細胞或小病灶，這部分殘留的腫瘤病灶既不能被手術(shù)完全切除也無法通過全身靜脈化療獲得很好的療效，這使得約60%的卵巢癌患者最終死于腹腔內(nèi)的腫瘤復(fù)發(fā)［11］。卵巢癌病灶通常局限于腹腔內(nèi)，正因為如此卵巢癌患者進行腹腔內(nèi)化療具有很強的理論基礎(chǔ)［12］。腹腔熱灌注化療是一種腫瘤局部治療方法，在各種原發(fā)或繼發(fā)腹膜癌的治療中有較好療效，HIPEC可將缺乏血管的腫瘤組織和游離的腫瘤細胞暴露于高濃度的化療藥物中，同時由于血液-腹膜屏障的存在，化療藥物局限于腹腔內(nèi)很難進入血液循環(huán)，從而減少化療全身副反應(yīng)。完整細胞滅減數(shù)后的HIPEC在腹膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者的治療中產(chǎn)生了令人滿意的效果［13，14］，不僅可以延長中位PFS和中位OS，還可降低死亡風(fēng)險。

鉑類聯(lián)合紫杉醇全身靜脈化療方案是晚期上皮性卵巢癌患者的一線治療方案，因此在卵巢癌腹水患者的HIPEC中仍然延續(xù)使用鉑類和紫杉醇。國內(nèi)外研究中，順鉑是卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移患者最常用的腹腔化療藥物，但存在比較嚴重的不良反應(yīng)，因此其他藥物用于腹腔熱灌注化療也在進行療效的驗證［14］。紫杉醇是抗細胞內(nèi)微管化療藥物，通過特異性結(jié)合在小管J3位上，使微管蛋白出現(xiàn)聚合反應(yīng)，抑制微管蛋白自身解聚功能，這將影響細胞在有絲分裂時期紡錘體結(jié)構(gòu)的生成，最終阻礙腫瘤細胞繁殖與分裂。相比順鉑，紫杉醇穿透腹膜的能力極其有限，幾乎不到1mm，腹膜吸收率明顯降低［15］。這表明腹腔灌注紫杉醇適用于腹腔微轉(zhuǎn)移患者，且通過體外實驗已證實紫杉醇能夠增加抗腫瘤作用，同時可明顯降低全身毒性反應(yīng)［16］，GOG172Ⅲ期臨床研究的結(jié)果顯示，相比靜脈TP（紫杉醇聯(lián)合順鉑）方案，IP紫杉醇可有效提高患者的PFS及OS。由此可見，紫杉醇類藥物在卵巢癌患者的HIPEC中有良好的療效。

隨著紫杉醇新劑型的不斷研發(fā)，Nab-PTX廣泛用于晚期卵巢癌患者的全身化療，并被認為是一種低毒高效的新型紫杉類劑型［17］。Nab-PTX通過納米技術(shù)將紫杉醇與人血白蛋白結(jié)合在一起，形成大小約130nm的復(fù)合物顆粒。白蛋白在體內(nèi)的主要生理功能是運輸營養(yǎng)元素，腫瘤細胞的特征是較正常細胞更快的增殖和分化，因此腫瘤細胞需要更多地供能，也就更容易富集白蛋白。腫瘤血管內(nèi)皮細胞中的大量GP60受體在EPR效應(yīng)后被激活（白蛋白紫杉醇可通過細胞間連接泄漏），形成的Nab-PTX-GP60復(fù)合物可靶向結(jié)合SPARC（分泌蛋白，酸性和富含由腫瘤細胞分泌的半胱氨酸）。最后，新的復(fù)合物形成，并通過非溶酶體機制到達腫瘤組織腫瘤細胞中［18］。這些特征意味著腫瘤細胞需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)，這有助于結(jié)合更多的白蛋白紫杉醇，從而增加紫杉醇藥物的局部濃度。有文獻表明相比CRE-紫杉醇（CremophorEL紫杉醇是紫杉醇注射液），Nab-PTX能夠更好地滲入腹壁，且Nab-PTX的腹膜聚集濃度是傳統(tǒng)紫杉醇制劑的5倍。Nab-PTX不僅有更好的穿透效果，更高的腹膜組織濃度，同時全身血藥濃度低［19］。白蛋白紫杉醇的這些特征增加了紫杉醇在腫瘤組織中的濃度，且全身毒副反應(yīng)?。?9，20］。Neil D等人研究證實，等毒性劑量下應(yīng)用白紫較傳統(tǒng)紫杉醇的裸鼠無瘤生存期長，復(fù)發(fā)時間較長，腫瘤倍增時間短［21］。

Nab-PTX在多種惡性腫瘤的化療中均有良好療效，但在腹腔灌注中尚無研究證實其療效及安全性。Federico Coccoli-ni［19］等人將Nab-PTX運用于兔子腹腔灌注中，僅證實其相較于傳統(tǒng)紫杉醇制劑能夠更好地滲入腹壁并增加腹膜聚集程度，該研究能夠一定程度上證實Nab-PTX在腹腔灌注中的可行性，由于該實驗中的動物并未構(gòu)建動物腹水模型，因此腹腔灌注Nab-PTX對腹水的抑制程度和安全性仍不可知。因此在我們的研究中構(gòu)建了裸鼠卵巢癌腹水模型，為了進一步探索Nab-PTX單藥以及聯(lián)合抗血管生成藥物在腹腔灌注中是否同樣有良好的療效及安全性，在本研究中將順鉑、紫杉醇、白蛋白紫杉醇作為單藥組，對裸鼠腹水的控制情況及生存期進行比較。并在聯(lián)合用藥組將安維汀、恩度兩種抗血管生成藥物與白蛋白紫杉醇聯(lián)合使用，以觀察抗血管生成藥物的加入是否能在單藥的基礎(chǔ)上增加療效及生存時間。

結(jié)果證實白蛋白紫杉醇組的腹水局部控制時間比其他實驗組更長。另外，通過對生存曲線的分析，我們發(fā)現(xiàn)白蛋白紫杉醇可以延長裸鼠的總存活時間。本研究是探索將白蛋白紫杉醇用于控制惡性腹水的第一個動物實驗，動物實驗最初設(shè)計是在處死裸鼠后觀察腹膜和肝臟轉(zhuǎn)移情況，然而在實驗過程中所有死亡裸鼠均未見腹膜及肝臟轉(zhuǎn)移的實體腫瘤病灶。實驗過程中一部分實驗裸鼠沒有完全接受所有三次的腹膜內(nèi)藥物灌注，由于這部分裸鼠在第12天即開始出現(xiàn)死亡。這提示我們白蛋白紫杉醇用于腹腔灌注時的適當劑量需要進一步探索。