老年抑郁癥病人血清miR-132和miR-182的表達(dá)及與神經(jīng)營養(yǎng)因子的關(guān)系

曹業(yè)才 呂睿 王曉琪

抑郁癥在老年人中的發(fā)病率呈增高趨勢。老年人的神經(jīng)細(xì)胞常伴有萎縮及老化的病理特征，其基因表達(dá)特征可能具有獨(dú)特性[1]。微小RNA(microRNA)能調(diào)控神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命過程，其表達(dá)失調(diào)與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)[2]。microRNA的作用與靶基因的調(diào)控有關(guān)[3]。本研究在前期應(yīng)用生物信息學(xué)對老年抑郁癥病人有差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行篩選，選擇在老年人抑郁癥病人中可能表達(dá)異常，且罕見報(bào)道的微小RNA-132(microRNA-132, miR-132)和微小RNA-182(microRNA-182, miR-182)進(jìn)行研究，并應(yīng)用TargetScan軟件預(yù)測到miR-132和miR-182有共同的靶基因23個(gè)，選擇關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、人神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT-4)進(jìn)行研究[4]?；诖?，本研究旨在檢測老年抑郁癥病人血清中miR-132和miR-182含量，探討其意義，分析其與血清BDNF、NT-4的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2017年8月至2019年6月在我院確診為抑郁癥的老年病人63例作為觀察組。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合國際疾病分類(ICD-10)中抑郁障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≥60歲；(3)漢密爾頓抑郁量表(HAMD-17)評分均≥17分。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院前1個(gè)月內(nèi)應(yīng)用過抗抑郁治療的藥物；(2)伴有惡性腫瘤；(3)家屬不同意。63例中男33例，女30例，年齡60～88歲，平均(69.5±9.5)歲，病程5～302個(gè)月，其中首發(fā)28例，復(fù)發(fā)35例(復(fù)發(fā)次數(shù)為2～8次)。選擇經(jīng)體檢證實(shí)為無明顯器質(zhì)性疾病及精神、神經(jīng)疾病的老年人63例作為對照組，其中男32例，女31例，年齡60～80歲，平均(65.8±9.1)歲。2組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，病人或家屬簽屬知情同意書。

1.2 資料收集 收集觀察組病人的性別、年齡、病變嚴(yán)重程度、發(fā)病時(shí)間、是否首次發(fā)病、精神障礙陽性家族史及首次發(fā)病年齡相關(guān)資料，檢測血清中BDNF和NT-4的表達(dá)量。檢測觀察組與對照組血清中miR-132和miR-182中的表達(dá)量。

1.3 方法

1.3.1 miR-132和miR-182的檢測：抽取2組的空腹靜脈血3 mL，3000 r/min離心20 min，留取血清。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qPCR)檢測miR-132和miR-182含量。首先在血清中提取總microRNA。miR-132引物上游：5′-TCGATGTGCGAAATGTACTG-3′，下游：5′-TCGCCAACGTGTACGCTAT-3′。miR-182引物上游：5′-ACTGTGCGACGTGCGTGATG-3′，下游：5′-ACTGTGCACGTGCAAACTGG-3′。U6為內(nèi)參，引物上游：5′-CACGAGAGAACGCGCATTA-3′下游：5′-GCAGTCATTCAACTCGAATC-3′。引物由廣州達(dá)瑞生物技術(shù)公司合成。嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)要求完成操作。PCR程序設(shè)定：50 ℃ 2 min，循環(huán)1次；95 ℃ 30 s，64 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，15個(gè)循環(huán)；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)。在60 ℃采集信號，記錄Ct值，以2-ΔΔCt表示miR-132和miR-182的表達(dá)量。

1.3.2 BDNF的檢測：采用ELISA法檢測病人血清中BDNF的水平。試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，用450 nm的酶標(biāo)儀測量各個(gè)孔內(nèi)的吸光度值(OD)，依據(jù)OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查取對應(yīng)的BDNF值。樣本集中檢測，注意避免污染，減少人為誤差。

1.3.3 NT-4的檢測：采用Western Blot法檢測病人血清中的NT-4水平。試劑購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。提取分離的血清中蛋白，測定蛋白濃度后，按步驟進(jìn)行蛋白變性、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)膜及免疫雜交，加入超敏發(fā)光液，發(fā)光3 min。將膜取出放入X膠片盒曝光3 min，顯影20 s。采用Image J分析數(shù)據(jù)，以相對量作為結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)整理后應(yīng)用SAS 6.12進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分表示，組間比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組中miR-132和miR-182表達(dá)的比較 與對照組比較，觀察組中miR-132和miR-182高表達(dá)。見表1。

2.2 觀察組不同臨床特征病人中miR-132和miR-182表達(dá)情況比較 miR-132和miR-182在不同病變嚴(yán)重程度、發(fā)病時(shí)間和是否首次發(fā)病的病人中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-132在有無精神障礙家族史病人中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組中miR-132和miR-182表達(dá)的比較(n=63)

表2 觀察組不同臨床特征病人中miR-132和miR-182

2.3 觀察組miR-132、miR-182與BDNF的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，miR-132和miR-182與BDNF均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.56和-0.51,P分別為0.016和0.023)。

2.4 觀察組miR-132、miR-182與NT-4的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，miR-132和miR-182與NT-4均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.65和-0.52,P分別為0.003和0.040)。

2.5 觀察組miR-132與miR-182的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，miR-132與miR-182具有正相關(guān)性(r=0.46,P=0.039)。

3 討論

老年人常具有老化及神經(jīng)系統(tǒng)萎縮的病理改變，其發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制可能較為特殊。機(jī)體中神經(jīng)營養(yǎng)因子對維持神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和功能有重要價(jià)值，老年人神經(jīng)細(xì)胞萎縮可以使神經(jīng)細(xì)胞受損，這種損傷因素使神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)損傷性改變。老年抑郁癥病人神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常，突觸傳遞與可塑性出現(xiàn)明顯變化，基因表達(dá)量增加，這些均與miRNA的調(diào)節(jié)有關(guān)[5]。microRNA是復(fù)雜分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分，其發(fā)揮作用的方式是與靶 mRNA 的 3’UTR 進(jìn)行結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA 下游的靶因子來調(diào)控細(xì)胞的病理過程[6]。本研究篩選出的miR-132和miR-182具有調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用[7-8]。BDNF和NT-4在抑郁癥中的表達(dá)降低，尤其是急性期下降更明顯，但是從急性期到恢復(fù)期較正常人血清中的表達(dá)仍為較低的水平。BDNF不僅在神經(jīng)營養(yǎng)中起作用，還有人認(rèn)為BDNF可作為判斷抑郁發(fā)作的標(biāo)志物[9]。BDNF能引起神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)時(shí)新生神經(jīng)元的生長，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)起到一定的保護(hù)作用[10]。NT-4在正常機(jī)體中有一定程度的表達(dá)，可以誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，使前體的神經(jīng)元成熟。NT-4表達(dá)下調(diào)后，通過突觸前受體信號AMPA受體的作用，減少神經(jīng)細(xì)胞可塑性[11]。

本研究結(jié)果顯示，miR-132和miR-182在老年抑郁癥病人血清中高表達(dá)，且具有協(xié)同作用，提示二者是病變形成的重要影響指標(biāo)。老年人神經(jīng)細(xì)胞的萎縮性病變可能對miR-132和miR-182高表達(dá)有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示miR-132和miR-182在不同病變嚴(yán)重程度、發(fā)病時(shí)間和是否首次發(fā)病的分組中表達(dá)有差別，提示二者對病變進(jìn)展有促進(jìn)作用。miR-132的表達(dá)與精神障礙家族史有關(guān)，提示miR-132可能是精神疾病遺傳性病變的調(diào)控因子。miR-132和miR-182高表達(dá)能引起神經(jīng)細(xì)胞損傷和修復(fù)障礙，損傷的神經(jīng)細(xì)胞可以分泌miR-132，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞周圍的炎癥環(huán)境，這種作用需要轉(zhuǎn)化酶和炎癥小體的參與。這種作用在老年人神經(jīng)細(xì)胞中的作用較為明顯，且受氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)[12-13]。miR-182在機(jī)體中的作用途徑可能更多，如減少巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的吞噬作用，使損傷因子清除能力下降[14-15]。本研究結(jié)果顯示，抑郁癥病人血清中miR-132、miR-182與BDNF呈負(fù)相關(guān)。本研究前期進(jìn)行的生物信息分析顯示，miR-132和miR-182下游共同的調(diào)控基因較多，BDNF是二者共同的靶基因，本研究也證實(shí)了二者對BDNF的調(diào)節(jié)作用，推測miR-132和miR-182對神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用與抑制BDNF的表達(dá)有關(guān)。miR-182能夠?qū)z傳基因進(jìn)行有效的調(diào)控，對染色質(zhì)修復(fù)和區(qū)段的重塑有一定價(jià)值[16]。miR-182對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用可能是對BDNF調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-132與精神障礙家族史有關(guān)，提示miR-132可能對判斷遺傳因素有一定價(jià)值。miR-132具有的功能較多，其低表達(dá)狀態(tài)是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的保護(hù)因素[17]，另一方面,如果miR-132增加迅速，可以引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)炎性小體的活性增強(qiáng)，伴隨著氧自由基的產(chǎn)生及神經(jīng)細(xì)胞的損傷[18]。

總之，老年抑郁癥病人血清中miR-132和miR-182表達(dá)升高，與病變的形成和進(jìn)展可能有一定相關(guān)性。miR-132和miR-182可能對神經(jīng)保護(hù)因子有一定的調(diào)節(jié)作用。