黃芪丹參對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠雄激素/胰島素受體表達(dá)影響的研究

麥秀云 張靜 郭樂琴

摘要 目的：研究黃芪聯(lián)合丹參對(duì)多囊卵巢綜合征（PCOS）模型大鼠雄激素（AR）及胰島素受體（INSR）表達(dá)的影響。方法：通過對(duì)大鼠注射外源性雄激素建立高雄激素?zé)o排卵模型，將建模成功的大鼠隨機(jī)分為黃芪組、丹參組、黃芪+丹參聯(lián)合組以及模型組，每組10只，分別以黃芪、丹參、黃芪+丹參聯(lián)合用藥行不同干預(yù)治療，模型組用生理鹽水灌胃。比較各組大鼠血清雄激素、胰島素水平;卵巢AR、INSR mRNA及蛋白水平。結(jié)果：1）與模型組比較，黃芪組血清睪酮水平明顯下降，丹參組血清胰島素水平明顯下降;聯(lián)合組血清睪酮及胰島素水平均明顯下降。2）與模型組比較，黃芪組INSR蛋白水平明顯下降，丹參組INSR蛋白水平明顯上升;黃芪+丹參聯(lián)合組AR蛋白水平明顯下降，同時(shí)INSR蛋白水平明顯升高。3）與模型組比較，黃芪組AR mRNA水平明顯下降，丹參組INSR mRNA水平明顯上升;黃芪+丹參聯(lián)合組AR mRNA水平明顯下降，同時(shí)卵巢INSR mRNA水平明顯升高。結(jié)論：黃芪可改善PCOS的高雄激素狀態(tài)，丹參可改善PCOS的高胰島素狀態(tài)，聯(lián)合用藥兼具抗雄激素及降低胰島素的作用，AR、INSR表達(dá)的改變是其可能的作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞 多囊卵巢綜合征;聯(lián)合;黃芪;丹參;雄激素受體;胰島素受體;mRNA;蛋白

Abstract Objective：To study the effects of Radix Astragali seu Hedysari and Radix Salviae Miltiorrhizae on the expression of androgen receptor and insulin receptor of rats with polycystic ovary syndrome（PCOS）.Methods：The model of hyperandrogen anovulatory was established by injecting exogenous androgen.Rats successfully modeling were randomly divided into an Radix Astragali seu Hedysari group（n=10），a Radix Salviae Miltiorrhizae group（n=10），a combined group（n=10）and a model group（n=10）.The rats were treated with Radix Astragali seu Hedysari，Radix Salviae Miltiorrhizae and Radix Astragali seu Hedysari+Radix Salviae Miltiorrhizae for different interventions.The rats in the model group were given the same dose of saline by gavage，The levels of serum androgen and insulin，ovarian AR，INSR mRNA and protein levels were compared in each group.Results：Compared with the model control group，1）the serum testosterone level was significantly decreased in the Radix Astragali seu Hedysari group，the serum insulin level was significantly decreased in the Radix Salvia Miltiorrhiza group，and the serum testosterone and insulin levels were significantly decreased in the combined group.2）the level of INSR protein in Radix Astragali seu Hedysari group was significantly decreased，the level of INSR protein in Radix Salvia Miltiorrhiza group was significantly increased，the level of AR protein in the combined group was significantly decreased，INSR protein in ovary was significantly increased in combined group.3）the level of ovarian AR mRNA in Radix Astragali seu Hedysari group was significantly decreased，the level of INSR mRNA in Radix Salviae Miltiorrhizae group was significantly increased，and the level of AR mRNA in combined group was significantly decreased while the level of ovarian INSR mRNA was significantly increased.Conclusion：Radix Astragali seu Hedysari can improve the hyperandrogen state of PCOS，Salvia miltiorrhiza can improve the hyperinsulin state of PCOS.Combination medication has anti-androgen and insulin-lowering effects.The change of AR and INSR expression is one of the possible mechanisms.

Keywords Polycystic ovary syndrome; Combination; Radix Astragali seu Hedysari; Radix Salviae Miltiorrhizae; Androgen receptor; Insulin receptor; mRNA; Protein

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.009

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）確切的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，但普遍認(rèn)為胰島素抵抗和高雄激素血癥是2個(gè)主要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，因此控制高雄激素、糾正異常糖代謝，已成為治療PCOS的重要方向[1]。臨床上分別使用含有黃芪或丹參的方劑，觀察結(jié)果顯示有降雄激素、胰島素和增加PCOS患者妊娠率的作用[2-3]。但黃芪與丹參兩者聯(lián)合使用對(duì)PCOS高雄激素、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的治療效果及作用機(jī)制，目前尚無(wú)報(bào)道。本研究擬通過對(duì)大鼠注射外源雄激素建立PCOS動(dòng)物模型，分別以黃芪、丹參、黃芪+丹參聯(lián)合用藥，比較不同干預(yù)組、對(duì)照組間雄激素及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的差異，以及卵巢雄激素、胰島素受體mRNA水平的差異，從對(duì)卵巢中雄激素受體（AR）、胰島素受體（INSR）影響的角度，探討中藥黃芪、丹參對(duì)PCOS大鼠模型抗雄激素/改善胰島素抵抗的效應(yīng)和作用機(jī)制，評(píng)估黃芪、丹參及聯(lián)合應(yīng)用治療PCOS的療效。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)9日齡SD雌性大鼠[廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（粵）2009-0015]，所有動(dòng)物飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件：溫度（22±1.5）℃，濕度（50±2.0）%，以12/12 h為光暗交替周期。

1.1.2 藥物 脫氫表雄酮（SIGMA公司，德國(guó)，批號(hào)：25102173）;黃芪顆粒（四川百利藥業(yè)，批號(hào)：Z19993381），丹參顆粒（湖北天圣康迪藥業(yè)，批號(hào)：Z19994069）。

1.1.3 試劑與儀器 T（批號(hào)：2004121915），INS（批號(hào)：201012348）放免試劑盒，購(gòu)自生物工程有限公司;RNA提取試劑盒（貨號(hào)：C11730-025），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：DRR037A），購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;RT-PCR儀（Appendorf，德國(guó)，型號(hào)：SimpliAmp）;實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI，美國(guó)，型號(hào)：QuantStudio 7）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只SPF級(jí)9日齡SD雌性大鼠，按照數(shù)字隨機(jī)法分為空白組（n=10）、模型組（n=50），其中模型組大鼠接受PCOS模型制備，按俞瑾等方法建立動(dòng)物模型[4]，造模結(jié)束20 d后，進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片，染色干燥后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化確定大鼠動(dòng)情周期的情況。同時(shí)稱量造模后大鼠體質(zhì)量，與正常組比較，以確定建模效果。將建模成功的40只大鼠隨機(jī)分為黃芪組、丹參組、聯(lián)合組以及模型組，每組10只。各組大小鼠體質(zhì)量、鼠齡等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2.2 干預(yù)方法 將造模成功的SD大鼠（n=40）隨機(jī)分為黃芪組、丹參組、黃芪+丹參聯(lián)合組、模型對(duì)照組4組，每組10只。第29天開始分別以黃芪0.24 g/kg體質(zhì)量/d，丹參0.4 g/kg體質(zhì)量/d，黃芪、丹參聯(lián)合，給予各組相應(yīng)藥物，模型組及空白組大鼠予生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)20 d。各組灌胃容積為20 mL/kg。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 血清睪酮、胰島素水平 干預(yù)后每組隨機(jī)取3只大鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后取下腔靜脈血，采用放射免疫（RIA）法測(cè)定血清中睪酮、胰島素水平，操作步驟按試劑盒說明書。

1.2.3.2 卵巢AR、INSR蛋白表達(dá) 干預(yù)結(jié)束后利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出卵巢組織，按照100 mg∶ 0.5 mL裂解液的比例加入適量1%PMSF蛋白裂解液，勻漿后室溫下靜置10 min后，用BCA試劑盒測(cè)定樣本總蛋白，根據(jù)結(jié)果得出上樣量后進(jìn)行電泳跑膠，轉(zhuǎn)膜，加入AR、INSR及β-actin一抗，比例均按照1∶ 1 000稀釋，再進(jìn)行生物辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的二抗孵育，最后顯影、拍攝，用Image（BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進(jìn)行處理，測(cè)定各樣本灰度值。

1.2.3.3 卵巢AR、INSR mRNA表達(dá) 干預(yù)后利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出卵巢組織，勻漿，按RNA trizol試劑盒說明提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由Takara公司合成，見表1，以β-actin為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為20 μL，SYBR Green PCR master mix（Roche）10 μL，cDNA2 μL，正反引物為1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min。95 ℃15 s，60 ℃ 1 s，共40個(gè)循環(huán)。讀取Ct（Cycle threshold）值，采用2-△△Ct方法分析結(jié)果。引物序列如下：Β-actin上游：TGTCACCAACTGGGACGATA下游：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA;AR上游：AGGAGGGCAGATCCTGTCTA下游：ATCCTGCCTCCTCGTCCTCTT;INSR上游：CGGCCCGATGCTGAGAACAAC下游：CCCTTGCCCCTTTCCGATAG。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)或兩樣本秩和檢驗(yàn);組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)或配對(duì)秩和檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建模效果評(píng)估 1）大鼠體質(zhì)量變化：用藥后PCOS組大鼠體質(zhì)量（201.2±27.5）g，明顯高于造模前（132.8±39.83）g，2者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2）陰道細(xì)胞涂片：40只大鼠陰道涂片始終為動(dòng)情間期，持續(xù)上皮角化，2只大鼠陰道涂片為不規(guī)律動(dòng)情周期，示無(wú)排卵。該模型大鼠存在體質(zhì)量增加、持續(xù)無(wú)排卵及雄激素增加，是較理想的PCOS動(dòng)物模型。

2.2 各組血清睪酮、胰島素水平變化 與空白組比較，模型組血清睪酮及胰島素水平均明顯上升（P<0.05）。與模型組比較，黃芪組、黃芪+丹參聯(lián)合組血清睪酮水平明顯下降（P<0.05）。說明黃芪及黃芪丹參聯(lián)合用藥能降低PCOS大鼠的血清睪酮水平。與模型組比較，丹參組與聯(lián)合用藥組血清胰島素水平明顯下降（P<0.05）。說明丹參及黃芪+丹參聯(lián)用可降低血清胰島素水平。而黃芪+丹參聯(lián)用可以同時(shí)降低血清睪酮及血清胰島素水平。見表1。

2.3 各組卵巢AR、INSR蛋白水平變化 與模型組比較，黃芪組卵巢雄激素受體蛋白水平明顯下降，丹參組卵巢胰島素受體蛋白水平明顯上升;黃芪+丹參聯(lián)合組卵巢雄激素受體蛋白水平明顯下降，同時(shí)卵巢胰島素受體蛋白水平明顯升高。見圖1，表2。

2.4 各組卵巢AR、INSR mRNA水平變化 與空白組比較，模型組卵巢AR mRNA水平明顯升高，而INSR mRNA水平明顯下降（P<0.05）。與模型組比較，黃芪組、黃芪+丹參聯(lián)合組卵巢AR mRNA表達(dá)水平明顯下降（P<0.05），說明黃芪以及黃芪+丹參聯(lián)合用藥可抑制PCOS大鼠卵巢中AR的表達(dá)。與模型組比較，丹參組及黃芪+丹參聯(lián)合組卵巢INSR mRNA表達(dá)水平明顯上升（P<0.05），說明丹參以及黃芪加丹參聯(lián)合用藥可增強(qiáng)卵巢INSR mRNA的表達(dá)。而黃芪加丹參聯(lián)合用藥則可抑制PCOS大鼠卵巢AR基因的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)INSR基因的表達(dá)。見表3。

3 討論

PCOS是常見的生殖內(nèi)分泌疾病，以高雄激素、胰島素抵抗為主要特征。近年來，PCOS中受體因素的作用吸引了越來越多的關(guān)注[5-7]。PCOS許多病理特征都受著AR的影響。高雄激素在女性PCOS中引起的一系列病理生理變化是通過AR實(shí)現(xiàn)的。研究表明：雄激素致無(wú)排卵模型動(dòng)物（Androgen Sterilized Rats，ASR）的血雄激素水平升高，上調(diào)胰腺、下丘腦及卵巢AR的表達(dá)，引起該模型的高LH血癥和無(wú)排卵[8-9]。

胰島素抵抗是胰島β細(xì)胞發(fā)生代償效應(yīng)的表現(xiàn)，是PCOS的糖脂代謝的重要原因之一。當(dāng)外周組織對(duì)葡萄糖進(jìn)行攝取時(shí)對(duì)胰島素的敏感度下降，隨之胰島素的相關(guān)生物效應(yīng)減弱，從而引起血糖升高，應(yīng)激性得導(dǎo)致機(jī)體所需胰島素量增加，誘發(fā)胰島β細(xì)胞分泌過量的胰島素，故血液中的胰島素水平上調(diào)，出現(xiàn)代償性的高胰島素血癥[10-12]。研究表明，PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞胰島素受體（Insulin Receptors，INSR）表達(dá)異常，可導(dǎo)致胰島素抵抗/高胰島素血癥，多數(shù)PCOS患者因體內(nèi)激素水平產(chǎn)生改變，影響了脂肪代謝，出現(xiàn)向心性肥胖體態(tài)，這亦是PCOS的典型特征之一。有研究表明，胰島素受體表達(dá)異常是胰島素抵抗發(fā)生的重要機(jī)制，胰島素受體在PCOS體內(nèi)異常降低，這與本研究結(jié)果一致，因此上調(diào)胰島素受體的水平，調(diào)節(jié)糖脂代謝是治療PCOS的關(guān)鍵[13-15]。胰島素抵抗與下丘腦-垂體-卵巢軸紊亂息息相關(guān)，而下丘腦-垂體-卵巢軸紊亂亦被認(rèn)為是PCOS的病理特征，二者協(xié)同作用，最終導(dǎo)致雄激素上調(diào)。有研究顯示雄激素受體在竇卵泡中有大量表達(dá)，提示雄激素受體的增多影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)間接說明雄激素可影響卵泡細(xì)胞停留于竇卵泡階段的時(shí)長(zhǎng)，雄激素可能阻滯了卵泡細(xì)胞的成熟，進(jìn)而導(dǎo)致PCOS機(jī)體生殖能力減弱，故降低雄激素是治療PCOS的關(guān)鍵[16-19]。

臨床上使用含有黃芪或丹參的方劑，有降雄激素和增加PCOS患者妊娠率的作用[20]。對(duì)32例PCOS患者聯(lián)合應(yīng)用黃芪多糖和達(dá)英-35共3個(gè)月，觀察治療前后血性激素、胰島素敏感性及血脂的改變，可以有效改善PCOS患者胰島素抵抗和高雄激素狀態(tài)及血脂代謝。但以上少量的臨床觀察研究均不能解釋黃芪、丹參在PCOS中確切的作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)：與正常組比較，ASR模型組血清雄激素水平和胰島素水平均明顯升高;與正常組比較，模型組卵巢中AR水平顯著升高而INSR水平顯著下降。說明ASR模型很好地模擬了PCOS的高雄激素/高胰島素的病理生理變化。分別用黃芪、丹參、黃芪+丹參聯(lián)合用藥對(duì)PCOS大鼠進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)黃芪、黃芪及丹參聯(lián)合用藥不僅降低PCOS大鼠的高雄激素水平，也降低了其高雄激素受體mRNA水平，但單用丹參則沒有明顯的降低PCOS大鼠雄激素及雄激素受體表達(dá)的作用。丹參、黃芪+丹參聯(lián)合用藥可降低PCOS大鼠的胰島素水平，升高胰島素受體mRNA表達(dá)水平，但單用黃芪則無(wú)改善PCOS大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的作用。

因此，黃芪和丹參聯(lián)用可改善PCOS大鼠的高雄激素血癥，其可能的作用機(jī)制是通過抑制血清雄激素水平和卵巢雄激素受體水平實(shí)現(xiàn);亦可同步改善PCOS大鼠的高胰島素血癥，其可能的作用機(jī)制為通過降低胰島素水平，增強(qiáng)胰島素受體水平實(shí)現(xiàn)的。

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（2019-05-17收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）