消腫散外敷與冰敷對(duì)骨骼肌損傷模型大鼠中MDA含量和LDH活性的影響

王強(qiáng) 胡勁松 李飛躍

摘要 目的：探討消腫散外敷與冰敷對(duì)骨骼肌損傷模型大鼠中MDA含量和LDH活性的影響。方法：采用打擊造模的方法，將86只SD大鼠造成急性軟組織損傷模型。造模后將動(dòng)物分為模型組20只、消腫散組20只、冰敷組20只、聯(lián)合組20只、本底組6只。觀察治療后1 d，3 d，7 d，14 d MDA含量、LDH活性變化情況。結(jié)果：1）造模1 d后，MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步進(jìn)行q檢驗(yàn)兩兩比較，冰敷消腫散聯(lián)合組的MDA含量低于損傷模型組（P<0.05）。造模3 d、7 d及14 d后，消腫散組、冰敷消腫散聯(lián)合組的MDA含量均低于損傷模型組（P<0.05）。2）造模3 d后，冰敷消腫散聯(lián)合組的LDH活性低于損傷模型組（P<0.05）。造模7 d后，消腫散組、冰敷消腫散聯(lián)合組的LDH活性低于損傷模型組（P<0.05）。造模14 d后，消腫散組、冰敷組和冰敷消腫散聯(lián)合組的LDH活性低于損傷模型組（P<0.05）。結(jié)論：消腫散和冰敷消腫散聯(lián)合運(yùn)用均能使損傷的軟組織中MDA含量減少和LDH活性降低，對(duì)骨骼肌損傷有一定抑制作用，能改善肌肉組織形態(tài)修復(fù)程度。

關(guān)鍵詞 冰敷;消腫散;骨骼肌;損傷;丙二醛;乳酸脫氫酶

Abstract Objective：To investigate the effect of Xiaozhong Powder and ice compress detumescence on MDA content and LDH activity in the model rats with injured skeletal muscle.Methods：By using the method of blow-up modeling，a total of 86 SD rats were made into acute soft tissue injury models.After modeling，the animals were divided into a model group of 20 animals，a Xiaozhong Powder group of 20 animals，a ice compress group of 20 animals，a combined group of 20 animals，and a background group of 6 animals.The changes of MDA content and LDH activity 1 d，3 d，7 d，14 d after treatment were observed.Results：1）After 1 day of model making，there was a statistically significant difference in MDA content，which was further compared by q test.The content of MDA in the combined ice compress Xiaozhong Powder group was lower than that of the injury model group（P<0.05）.After 3，7 and 14 days，MDA content in the Xiaozhong Powder group and the ice compress detumescence combined group was lower than that in the model group.After 3 days modeling，the LDH activity of the Xiaozhong Powder group and ice compress detumescence combined group were lower than the model group.After 7 days modeling，LDH activity in the Xiaozhong Powder group and the ice compress detumescence combined group was lower than that in the model group.After 14 days modeling，LDH activity of the Xiaozhong Powder group，the ice compress detumescence group and the combined group was lower than the model group（P<0.05）.Conclusion：Xiaozhong Powder and ice compress detumescence powder can reduce MDA content and LDH activity in injured soft tissues，inhibit skeletal muscle injury to a certain extent，and improve the repair degree of muscle tissue morphology.

Keywords Ice compress; XiaozhongPowder; Skeletal muscle; Injury; MDA; LDH

中圖分類號(hào)：R274.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.006

骨骼肌損傷是臨床最為常見的軟組織損傷疾病，是常見病多發(fā)病。其中以急性損傷為多，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療上采用傳統(tǒng)的制動(dòng)、冰敷及配合消腫藥物，其中冰敷的治療方法已是公認(rèn)的行之有效的方法。而中醫(yī)多以早期外敷清熱消腫、活血化瘀止痛中藥加局部制動(dòng)治療，臨床癥狀改善亦效如桴鼓?！跋[散”，又名“三圣散”，是瑞金醫(yī)院魏氏傷科名方，其全方藥物組成少，效宏力專，已具有40余年的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，具有良好的清熱消腫、活血止痛作用和療效[1-2]。本研究通過(guò)觀察冰敷和消腫散對(duì)急性軟組織損傷模型大鼠的干預(yù)，測(cè)定其血清MDA丙二醛（Maleic Dialdehyde，MDA）含量和乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）的活性，以及對(duì)肌肉組織形態(tài)學(xué)的觀察，來(lái)探討冰敷和消腫散對(duì)大鼠骨骼肌的抑制肌肉損傷的作用以及改善矯揉做作形態(tài)修復(fù)程度的情況，以期進(jìn)一步了解冰敷加用消腫散是否有協(xié)同增效作用，同時(shí)通過(guò)探討其作用機(jī)制為臨床提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 委托上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司清潔級(jí)SD健康大鼠86只，體質(zhì)量每只200 g左右。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度為恒溫（20 ℃±2 ℃），給予標(biāo)準(zhǔn)光照自動(dòng)光-暗控制（LD12：12，即07：00～19：00光照，19：00～07：00暗置），相對(duì)濕度60% ～65%，動(dòng)物攝食飲水自由。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心許可證號(hào)：SYXK（滬）2013-0016。

1.1.2 藥物 消腫散（落得打、芙蓉葉、赤小豆等），本院提供，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：分析純AR80109218）;無(wú)核酸酶水（麥約爾公司，批號(hào)：150728）;Trizol裂解液（Invitrogen公司，美國(guó)，批號(hào)：cat#15596-026）;DEPC水（SIGMA公司，美國(guó)，批號(hào)：Cas1609-47-8）;丙二醛（MDA）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號(hào)：A003-1）;乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號(hào)：A020-2）。

紫外分光光度計(jì)（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：NanoDrop2000）;超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司，型號(hào)：sw-cj-2d）;水浴鍋（上海誠(chéng)獻(xiàn)公司，型號(hào)：HWS-24）;超細(xì)勻漿機(jī)（上海標(biāo)本模型廠，型號(hào)：FJ150）;固體木質(zhì)圓柱體（自制，長(zhǎng)20 cm，質(zhì)量620 g）;Eppendorf管（AXYGEN公司，美國(guó)，批號(hào)：cat#MCT-150-C，cat#T-200-Y，cat#T-300，cat#T-1000-B）;臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（Sorvall公司，美國(guó)，型號(hào)：FrescoD-37520）;電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DK-S26）;酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：ELX800）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 除空白對(duì)照組外，大鼠腹腔3%戊巴比妥鈉注射麻醉（30 mg/kg），以固體木質(zhì)圓柱體從高處自由落下進(jìn)行1次打擊傷，致傷位置在右小腿內(nèi)側(cè)面（其為腓腸肌中段，打擊面φ為1 cm，下落物體長(zhǎng)度為20 cm，重量為620 g，從40 cm高處落下，重力6.08N，動(dòng)能2.43J）。先將造模后的動(dòng)物隨機(jī)編成1—86號(hào)，再將1—86號(hào)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物隨機(jī)分為損傷模型組20只、消腫散組20只、冰敷組20只、冰敷消腫散聯(lián)合組20只、本底對(duì)照組6只。

1.2.2 干預(yù)方法 空白對(duì)照組大鼠不作任何處理，自由活動(dòng)并常規(guī)飼養(yǎng)。消腫散組：將涂抹有消腫散的綿紙敷到致傷處，以透氣膠布包扎固定，隔天換1次膏藥，分別干預(yù)1 d、3 d、7 d、14 d。冰敷組：對(duì)大鼠致傷處外敷冰袋并膠布固定，30 min/d，1次/d，分別干預(yù)1 d、3 d、7 d、14 d。聯(lián)合組：先對(duì)大鼠致傷處進(jìn)行冰敷30 min，然后再貼敷消腫散，隔天換1次膏藥。每次換藥前先對(duì)致傷處進(jìn)行冰敷30 min，分別干預(yù)1 d、3 d、7 d、14 d。

分別于造模后5 min，1 d、3 d、7 d、14 d取材。造模后5 min為本底對(duì)照組，共6只大鼠取材。后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1 d、3 d、7 d、14 d）每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共20只大鼠取材（5只/組×4組）。取材部位為腓腸肌中段（致傷處）。樣本處理方法描述欠清晰：處死大鼠取其腓腸肌中段、清洗，切割，研磨，勻漿，保存，待測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 血清MDA的含量檢測(cè) 漩渦混勻器混勻，試管口用保險(xiǎn)薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95°C沸水浴40 min，取出后流水冷卻，然后3 500～4 000 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm。取上清，置于分光光度計(jì)（532 nm）處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。

1.2.3.2 血清LDH的活性檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將待測(cè)液體混勻，室溫放置5 min，波長(zhǎng)450 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。計(jì)算公式：血清中LDH活性（U/L）=（測(cè)定OD值-對(duì)照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.2 mmol/L）×1 000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清MDA的含量檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)過(guò)方差分析，各組之間造模1 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步進(jìn)行q檢驗(yàn)兩兩比較，冰敷消腫散聯(lián)合組的MDA含量低于損傷模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模3 d、7 d及14 d后，消腫散組、冰敷消腫散聯(lián)合組的MDA含量均低于損傷模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 血清LDH的活性檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)過(guò)方差分析，各組之間造模1 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步進(jìn)行q檢驗(yàn)兩兩比較，各組大鼠的LDH活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模3 d后，冰敷消腫散聯(lián)合組的LDH活性低于損傷模型組（P<0.05）。造模7 d后，消腫散組、冰敷消腫散聯(lián)合組的LDH活性低于損傷模型組（P<0.05）。造模14 d后，消腫散組、冰敷組和冰敷消腫散聯(lián)合組的LDH活性低于損傷模型組（P<0.05）。見表2。

3 討論

3.1 消腫散外敷與冰敷對(duì)骨骼肌損傷模型MDA含量的影響 MDA的含量反映了體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷程度[3]。MDA含量既可反映肌體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，也可反映生物膜的受損程度[4]。當(dāng)劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，體內(nèi)的氧化與抗氧化作用將失衡并導(dǎo)致細(xì)胞損傷，MDA含量的多少也間接反映了組織的損傷程度[5-7]。

本研究顯示造模第1天后冰敷及消腫散聯(lián)合組的MDA含量低于損傷模型組，其他組與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模3 d、7 d及14 d后，消腫散組、冰敷及消腫散聯(lián)合組的MDA含量均低于損傷模型組。其中冰敷組的MDA含量造模前后均不低于損傷模型組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

由此可知，消腫散、冰敷及消腫散聯(lián)合應(yīng)用可以使MDA的含量明顯降低，冰敷組中MDA的含量無(wú)明顯改變。損傷的骨骼肌內(nèi)部的MDA的生成減少，清除增多，說(shuō)明消腫散能在一定程度上改善機(jī)體骨骼肌氧自由基生成與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡，從而增強(qiáng)機(jī)體骨骼肌的抗氧化能力，減輕MDA引起的對(duì)骨骼肌損傷。

也就是說(shuō)，消腫散組、冰敷及消腫散聯(lián)合組能使骨骼肌的損傷程度降低，即有一定抑制損傷的作用。而冰敷組并沒有抑制骨骼肌損傷的作用。同時(shí)，可以看出冰敷及消腫散聯(lián)合運(yùn)用，冰敷也沒有抵消消腫散抑制損傷的作用。

3.2 消腫散外敷與冰敷對(duì)骨骼肌損傷模型LDH活性的影響 研究認(rèn)為L(zhǎng)DH活性的變化是肌肉損傷程度的重要指標(biāo)，其活性可以也反映骨骼肌的損傷程度[4，8]。

本研究顯示，造模1 d后各組大鼠的LDH活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模3 d后，冰敷及消腫散聯(lián)合組的LDH活性低于損傷模型組;造模7、14 d后，消腫散組、冰敷及消腫散聯(lián)合組的LDH活性低于損傷模型組;造模14 d后，冰敷組的LDH活性也低于損傷模型組。

LDH活性的降低，說(shuō)明在各組治療急性骨骼肌損傷進(jìn)程中，肌肉組織損害亦漸趨減輕，肌肉組織的修復(fù)漸趨增多。其中冰敷及消腫散聯(lián)合組在造模3、7、14 d后均出現(xiàn)LDH活性的降低，而消腫散組在造模后7、14 d出現(xiàn)LDH活性的降低;冰敷組僅在造模后14 d才出現(xiàn)LDH活性的降低。LDH的活性降低表明，骨骼肌的損傷程度降低。

由此可見，消腫散和冰敷消腫散聯(lián)合運(yùn)用均能使損傷的軟組織中MDA含量減少和LDH活性降低，對(duì)骨骼肌損傷有一定抑制作用，能改善肌肉組織形態(tài)修復(fù)程度。而冰敷對(duì)骨骼肌損傷的抑制作用不明顯;冰敷及消腫散聯(lián)合運(yùn)用，冰敷沒有抵消消腫散對(duì)骨骼肌損傷的抑制作用。

3.3 中藥外敷及冰敷治療骨骼肌損傷的認(rèn)識(shí) 有臨床研究認(rèn)為，冰敷聯(lián)合中藥外敷能很好地結(jié)合二者的良好功效，能夠通過(guò)抑制炎性反應(yīng)細(xì)胞或炎性反應(yīng)因子的滲出、浸潤(rùn)，從而早期緩解疼痛，控制腫脹;同時(shí)還能通過(guò)改善損傷部位的局部微循環(huán)，促進(jìn)病變的轉(zhuǎn)化吸收，從而促使損傷組織更快的修復(fù)[9-12]。

胡勁松等[13]研究發(fā)現(xiàn)，消腫散能促進(jìn)對(duì)骨骼肌的修復(fù);同時(shí)發(fā)現(xiàn)消腫散能使損傷的局部血管再生，能對(duì)肌肉組織形態(tài)的修復(fù)程度有一點(diǎn)改善。由此可見，消腫散既有促進(jìn)骨骼肌修復(fù)的作用，又有一定抑制骨骼肌損傷的作用，雙管齊下，促使損傷的骨骼肌盡快恢復(fù)。

臨床上，對(duì)于軟組織損傷西醫(yī)從采用RICE（Rest，Ice，Compression，Elevation），到運(yùn)動(dòng)廣泛的PRICE原則（Protection，Rest，Ice，Compression，Elevation），發(fā)展到2012年英國(guó)《運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)》雜志上強(qiáng)烈建議的POLICE原則[14]，都用到冰敷。與中醫(yī)的理氣活血化瘀的治療原則不同，中醫(yī)認(rèn)為寒性收引凝滯，不利于瘀血得化，宜活血為要。西醫(yī)的冰敷與中醫(yī)的活血化瘀的治療原則相矛盾。而冰敷和中藥外用對(duì)于軟組織損傷均有一定效果，均可緩解疼痛，消除腫脹，減少患者痛苦，提高患者生命質(zhì)量。有研究表明[15]踝關(guān)節(jié)扭傷消腫止痛膏組與冰敷組的踝關(guān)節(jié)腫脹程度、VAS評(píng)分療效比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。有研究認(rèn)為冷敷治療并未能獲得更大的終點(diǎn)效益，同時(shí)也沒有證據(jù)表明冷敷影響了關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)[16]。有研究表明對(duì)于踝關(guān)節(jié)扭傷三色敷藥組治療比冷敷組治療效果更好，更好地改善患者的主觀疼痛和消除瘀斑等，說(shuō)明活血化瘀的中藥有助于疼痛改善和瘀血消散[17-18]。

消腫散全方藥物組成少（芙蓉葉、赤小豆、落得打），效宏力專。其中主藥芙蓉葉，性味甘，微辛平，清熱解毒、消腫排膿。落得打，又稱積雪草，既有活血消腫止痛，又有清熱解毒利水的功效。赤小豆甘酸偏涼、其性下行，其效能專在利濕消腫、行血止痛。僅以幾味藥合用，共奏清熱消腫、行血止痛之效。有研究顯示，經(jīng)芙蓉葉提取物治療后的大鼠，與糖尿病模型組比較，給藥組大鼠血清SOD、GSH-PX和肝臟SOD、GSH顯著升高，表明木芙蓉葉提取物能提高糖尿病大鼠的抗氧化能力，增強(qiáng)組織清除自由基的能力[19]。有研究者認(rèn)為，積雪草具有抑制瘢痕增生、修復(fù)皮膚損傷、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫、抗?jié)兗翱咕?、消炎等多種藥理作用[20]。赤小豆也含有多種活性物，其不同溶劑提取物都具有一定的抗氧化能力，只是各自抗氧化能力大小存在明顯差異[21]。消腫散對(duì)急性軟組織損傷能較快消除局部受損組織液滲出，抑制炎性反應(yīng)，促使患部損傷組織修復(fù)，改善局部循環(huán)從而達(dá)到治療作用[2，22]。經(jīng)消腫散治療后，對(duì)損傷的骨骼肌，能增強(qiáng)清除自由基的能力以及抗氧化能力，同時(shí)還可能有一定抗炎鎮(zhèn)痛的作用。

骨骼肌損傷及修復(fù)的病理生理機(jī)制尚不清楚，在一般以分為4個(gè)階段：壞死、炎性反應(yīng)、再生和纖維化[23]。在對(duì)骨骼肌損傷的治療干預(yù)方面主要有3個(gè)方面，即控制炎性反應(yīng)、提高再生和抑制組織纖維化[24-25]。因此治療骨骼肌損傷多以減輕炎性反應(yīng)、增強(qiáng)肌肉再生、抑制纖維化，以提高或恢復(fù)肌肉功能并減少?gòu)?fù)發(fā)[13，26-27]。治療研究方面也大多圍繞促進(jìn)恢復(fù)和抑制損傷展開。因此我們認(rèn)為冰敷對(duì)軟組織損傷不一定能起到抑制的作用，促進(jìn)恢復(fù)也無(wú)明確證據(jù);而中藥外用對(duì)軟組織損傷確有一定抑制作用。

而本研究也存在一些不足，雖然冰敷臨床上對(duì)軟組織損傷有一定效果，但具體的病理生理機(jī)制仍尚不明確[14]。消腫散及冰敷消腫聯(lián)合應(yīng)用雖然對(duì)損傷的骨骼肌組織有一定損傷抑制和修復(fù)的能力，但并不能確定作用在整個(gè)骨骼肌損傷的再生和修復(fù)過(guò)程中處于某個(gè)具體階段，即對(duì)于其外敷消腫散或冰敷作用的時(shí)間節(jié)點(diǎn)不能具體到某個(gè)階段。對(duì)改善癥狀如疼痛、腫脹及活動(dòng)功能情況也未做進(jìn)一步研究。急性骨骼肌損傷的修復(fù)本身是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，需要多種物質(zhì)或細(xì)胞因子的參與，實(shí)驗(yàn)研究需要更深入的探討。以期后續(xù)研究對(duì)疼痛閾值、骨骼肌周徑、活動(dòng)度測(cè)量值，以及其他（如IL6、TNFα、CK、SOD、NFG、VEGF等）炎性反應(yīng)因子、生長(zhǎng)因子等深入探討，進(jìn)而證實(shí)消腫散具有抗炎消腫、活血止痛等作用，更好的指導(dǎo)臨床。本實(shí)驗(yàn)也為消腫散及其聯(lián)合冰敷的進(jìn)一步臨床運(yùn)用和提高奠定了良好的基礎(chǔ)，也為揭示消腫外敷治療急性軟組織損傷的作用機(jī)制提供一定依據(jù)，為臨床應(yīng)用的有效性提供一定的有利依據(jù)。

綜上所述，消腫散和冰敷消腫散聯(lián)合運(yùn)用均能使損傷的軟組織中MDA含量減少和LDH活性降低，對(duì)骨骼肌損傷有一定抑制作用，能改善肌肉組織形態(tài)修復(fù)程度。

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（2019-05-02收稿 責(zé)任編輯：王楊）