YAP1在食管癌中的表達(dá)及其對(duì)體外食管癌細(xì)胞培養(yǎng)化療敏感性的影響

張友明，姚 杰

(安徽省池州市人民醫(yī)院胸心外科，安徽池州 247100)

食管癌是我國高發(fā)的消化道腫瘤之一，每年食管癌死亡患者高達(dá)15萬人[1]。本病好發(fā)于40歲以上人群，男性患者多于女性，其典型癥狀以進(jìn)行性吞咽困難為主，晚期患者還可能出現(xiàn)胸背疼痛，以及氣管、支氣管、肝、腦等臟器轉(zhuǎn)移情況[2]。Yes相關(guān)蛋白1(YAP1)是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌路徑Hippo的重要調(diào)控因子。臨床研究顯示，YAP1在胃癌、非小細(xì)胞癌等多種腫瘤細(xì)胞中存在過度表達(dá)情況，提示高度活化的YAP1可能與胃癌、非小細(xì)胞癌等腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[3]。但YAP1在食管癌中的表達(dá)及意義，以及對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)化療敏感性的影響如何，臨床研究較少。為此，本研究選取本院保存的89例食管癌患者標(biāo)本進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年2月本院89例食管癌患者為研究對(duì)象，其中男49例，女40例；<60歲患者41例，≥60歲患者48例；食道上段18例，食道中段43例，食道下段28例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；(2)臨床病歷資料完整；(3)術(shù)前未行放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(2)有免疫系統(tǒng)疾病。食管癌患者的癌組織標(biāo)本89份納入食管癌組，癌旁組織(距癌邊緣>5 cm，病理結(jié)果確認(rèn)無癌細(xì)胞)標(biāo)本89份納入癌旁組織組。

1.2免疫組織化學(xué)染色 兩組標(biāo)本進(jìn)行石蠟切片，并行常規(guī)脫蠟至水，選用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供的PV-600免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，所有操作根據(jù)說明書進(jìn)行，將滴入YAP1抗體的標(biāo)本4 ℃冷藏過夜后，選用DAB進(jìn)行顯色，而后選用蘇木素復(fù)染，并于顯微鏡下觀察最終結(jié)果。

1.3體外藥敏試驗(yàn) 將食管癌標(biāo)本研磨碾碎，并滴加培養(yǎng)液，收集細(xì)胞懸液后于4 500 r/min，5 cm半徑條件下離心15 min，沉淀后加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打，最終獲取腫瘤單細(xì)胞懸液，選用小牛血清對(duì)標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，并制備成細(xì)胞濃度為5×104的細(xì)胞懸液，隨后將其接種至96孔板內(nèi)。設(shè)置羥基喜樹堿(HCPT)組、順鉑(CDDP)組、絲裂霉素(MMC)組氟尿嘧啶(5-FU)組、阿霉素(ADM)組及5個(gè)對(duì)照組，將15 μL 0.5 ng/mL抗腫瘤藥物滴入孔板內(nèi)，于室溫下，10% CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，取出后滴入15 μL 噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑，15 μL不完全培養(yǎng)液，靜置反應(yīng)3 h，4 000 r/min離心后，每孔滴入15 μL二甲基亞砜(DMSO)，反應(yīng)8 min，選用南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)的HBS-1096C自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔578 nm波長時(shí)的吸光度值，試驗(yàn)共重復(fù)2次，腫瘤細(xì)胞存活率取均值作為最終結(jié)果。

1.4判斷標(biāo)準(zhǔn) (1)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷：在高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，其中染色強(qiáng)度記分如下，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞比例<11%為1分，11%～<51%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞比例得分之積≥3分為陽性表達(dá)。(2)化療敏感性：腫瘤細(xì)胞存活率≤50%為敏感，而>50%為不敏感。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1食管癌組與癌旁組織組YAP1蛋白表達(dá) 食管癌組與癌旁組織組YAP1蛋白陽性表達(dá)率分別為69.66%(62/89)、16.85%(15/89)，食管癌組YAP1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為癌旁組織；B為食管癌組織。圖1 免疫組織化學(xué)染色圖(×200)

2.2YAP1蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 TNM分期Ⅲ期、中-低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者YAP1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 YAP1蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.3體外化療敏感性比較 YAP1陽性表達(dá)患者HCPT、CDDP、MMC敏感率分別為56.45%、30.65%和45.16%，明顯低于YAP1陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 YAP1陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者體外化療敏感性比較[n(%)]

3 討 論

Hippo信號(hào)路徑是近年發(fā)現(xiàn)的一組信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，其上游主要由調(diào)節(jié)分子Ex、Kibra等組成，核心分子則以Mst1/2、Mob1及Lats1/2等為主，效應(yīng)分子則由YAP1/TAZ構(gòu)成[4-5]。Hippo信號(hào)路徑活化時(shí)，效應(yīng)分子表達(dá)水平將被抑制，其與細(xì)胞核的結(jié)合能力也將損傷，并因此失去轉(zhuǎn)錄輔助因子功能，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1、結(jié)締組織生長因子等與增殖相關(guān)基因的表達(dá)能力被阻斷，細(xì)胞增殖受限；同時(shí)還可抑制DIPA1等與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，并加速細(xì)胞凋亡[6-7]。而當(dāng)Hippo信號(hào)路徑失活時(shí)，效應(yīng)分子YAP1/TAZ表達(dá)率將大幅增加，并進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制其凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞惡性化[8]。未分化的干細(xì)胞內(nèi)存在大量未磷酸化的YAP1，這些YAP1將介導(dǎo)Hippo信號(hào)路徑，并對(duì)干細(xì)胞的自我更新及增殖過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，最終影響組織器官的生長發(fā)育[9]。YAP1活性還可受Catenin蛋白調(diào)控，而Catenin蛋白同樣與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Catenin蛋白具有促細(xì)胞黏附，抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等功能。大量研究表明，惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Catenin蛋白表達(dá)明顯降低[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除YAP1基因后，干細(xì)胞含有的高遷移率族盒蛋白2及Oct4基因表達(dá)水平將大幅下降，甚至消失，而YAP1過度表達(dá)將誘使多能干細(xì)胞編程效率提升2倍[12]。本研究中，食管癌YAP1蛋白陽性表達(dá)率為69.66%，明顯高于癌旁組織，表明YAP1蛋白異常表達(dá)與食管癌密切相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，食管癌及食管不典型增生患者病灶組織內(nèi)可見YAP1同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，該研究認(rèn)為慢性炎性反應(yīng)癌變過程中，YAP1的高表達(dá)可能參與炎癥性疾病的惡性化，這也可能是YAP1參與惡性腫瘤發(fā)生的又一機(jī)制[13]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌病灶組織內(nèi)YAP1表達(dá)率明顯上升，高于健康組織，并且其表達(dá)率與患者疾病分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)與否有關(guān)[14]。本研究中，TNM分期Ⅲ期、中-低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者YAP1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，這與前述研究結(jié)果相似，提示YAP1與腫瘤疾病分期、分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

手術(shù)聯(lián)合輔助化療是多種惡性腫瘤的常用治療方案，但多數(shù)腫瘤患者存在先天性或獲得性放化療耐藥情況[15]。因此，有效地評(píng)估腫瘤患者藥物敏感性對(duì)食管癌的治療具有重要意義。本研究中，YAP1陽性表達(dá)患者對(duì)HCPT、CDDP和MMC的敏感率分別為56.45%、30.65%和45.16%，明顯低于YAP1陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而YAP1陽性表達(dá)和陰性表達(dá)患者對(duì)5-FU和ADM的敏感率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過對(duì)以上結(jié)果分析，可以發(fā)現(xiàn)YAP1陽性表達(dá)可降低食管癌患者對(duì)HCPT、CDDP和MMC的藥物敏感性，但對(duì)5-FU和ADM敏感性無明顯影響，臨床需酌情選用5-FU和ADM來治療YAP1陽性表達(dá)的食管癌患者。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌組織內(nèi)的YAP1蛋白陽性表達(dá)率明顯升高，并與TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，同時(shí)還對(duì)患者化療藥物敏感性存在一定影響，臨床可通過檢測(cè)YAP1來評(píng)估食管癌TNM分期、分化程度及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并提示患者對(duì)化療藥物的不同敏感性。但由于本組研究納入樣本量小，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。