不同耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥特征及常見(jiàn)耐藥基因檢測(cè)分析*

林雪霏，蔣月婷，鄧穎珊，賴斯華，寇曉霞，吳愛(ài)武△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州 510182;2.中山大學(xué)熱帶病防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510080;3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510230)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院獲得性感染的重要機(jī)會(huì)致病菌，可引起各種感染，包括呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、尿路感染、皮膚傷口感染、菌血癥和腦膜炎等[1-2]。隨著廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑及各種侵入性治療的廣泛使用，近年來(lái)，多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院感染中的檢出率不斷增加，這類細(xì)菌的耐藥特點(diǎn)、致病力等也成為臨床研究熱點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)不同耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥和生物膜基因進(jìn)行檢測(cè)和分析，以期了解本地區(qū)該類細(xì)菌的耐藥表型和耐藥基因特點(diǎn)，為臨床防控和抗感染治療提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院微生物室菌種庫(kù)收集2016年1月至2018年12月臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌共110株。

1.2儀器與試劑 VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；G∶BOX凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自信基國(guó)際貿(mào)易有限公司；雙向電泳分析儀購(gòu)自北京六一儀器廠；高壓滅菌鍋購(gòu)自江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；電泳瓊脂糖(Biowest)購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 110株收集菌株經(jīng)VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏分析。隨后再用PCR法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌特有的分子標(biāo)記blaOXA-51-like基因，進(jìn)一步確認(rèn)110株菌株均為鮑曼不動(dòng)桿菌，其中多重耐藥菌42株，泛耐藥菌43株，相對(duì)敏感菌25株。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌定義為對(duì)10類抗菌藥物中3類或者3類以上藥物不敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌；泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌定義為對(duì)10類抗菌藥物中8類或者8類以上藥物不敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌；其余菌株都?xì)w類為相對(duì)敏感鮑曼不動(dòng)桿菌。

1.3.2常見(jiàn)耐藥基因和生物膜基因的檢測(cè) 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。25.0 μL反應(yīng)體系：預(yù)混液12.5 μL，模板2.0 μL，10.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。引物序列合成及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[3-7]，引物序列見(jiàn)表1、2。在各基因陽(yáng)性的菌株中分別各取1株菌株，將其相應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到GenBank在線數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用比對(duì)工具BlastN進(jìn)行比對(duì)。

表1 鮑曼不動(dòng)桿菌常見(jiàn)耐藥基因引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌常見(jiàn)生物膜基因引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同耐藥性菌株的構(gòu)成比和藥敏分析結(jié)果 110株鮑曼不動(dòng)桿菌中，相對(duì)敏感菌25株，占22.7%(25/110)，相對(duì)敏感菌對(duì)大部分測(cè)試藥物敏感，這些菌株對(duì)頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦和環(huán)丙沙星均敏感。而多重耐藥菌42株，占38.2%(42/110)，多重耐藥菌對(duì)測(cè)試的抗菌藥物多表現(xiàn)為耐藥，耐藥率最低的是替加環(huán)素，為11.9%，其余抗菌藥物耐藥率均大于55.0%，對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為92.9%、95.2%，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為95.2%。泛耐藥菌43株，占39.1%(43/110)，泛耐藥菌對(duì)抗菌藥物高度耐藥，耐藥率最低的是替加環(huán)素，為4.7%，對(duì)其余抗菌藥物耐藥率均大于85.0%，對(duì)妥布霉素、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、氨曲南和環(huán)丙沙星均耐藥。

2.2常見(jiàn)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 在110株鮑曼不動(dòng)桿菌中，耐藥基因TEM和adeB具有較高檢出率，分別為64.5%、73.6%(均>50.0%)，未檢出耐藥基因parC。在25株相對(duì)敏感菌中，耐藥基因gyrA和adeB檢出率分別為40.0%和56.0%；在42株多重耐藥菌和43株泛耐藥菌中，耐藥基因TEM和adeB具有較高檢出率，多重耐藥菌的檢出率分別為88.1%和92.9%，泛耐藥菌的檢出率分別為76.7%和65.1%。見(jiàn)表3。

表3 不同耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌常見(jiàn)耐藥基因的檢出情況[n(%)]

對(duì)比不同耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因的檢出情況，多重耐藥菌的TEM、armA、adeB耐藥基因檢出率比相對(duì)敏感菌高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。泛耐藥菌的TEM耐藥基因檢出率比相對(duì)敏感菌高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相對(duì)敏感菌株的gyrA耐藥基因檢出率比泛耐藥菌株高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重耐藥菌的gyrA、armA、adeB耐藥基因檢出率比泛耐藥菌高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

攜帶TEM基因的71株菌株除對(duì)替加環(huán)素外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均大于70.0%；攜帶PER基因的3株菌株除對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、替加環(huán)素和左氧氟沙星外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均大于60.0%；攜帶gyrA基因的25株菌株除對(duì)妥布霉素、阿米卡星、復(fù)方磺胺甲噁唑和替加環(huán)素外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率大于50.0%；攜帶armA基因的15株菌株除對(duì)替加環(huán)素外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均大于60.0%；攜帶adeB基因的81株菌株除對(duì)替加環(huán)素外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率大于60.0%。見(jiàn)表4。

表4 110株攜帶不同耐藥基因鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率(%)

2.3常見(jiàn)生物膜基因檢測(cè)結(jié)果 在110株鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜基因檢測(cè)結(jié)果中，除了bla-PER1基因以外，AbaI、Csu E 、Csu C、Csu D、Omp A、surA1、Pld、paaE基因的檢出率均較高(>65.0%)。多重耐藥菌和泛耐藥菌的paaE生物膜基因檢出率比相對(duì)敏感菌高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重耐藥菌的surA1生物膜基因檢出率比泛耐藥菌高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 不同生物膜基因在不同耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌中的檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

3 討 論

近年來(lái)，由于抗菌藥物的濫用，鮑曼不動(dòng)桿菌在國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)多重耐藥，甚至泛耐藥的報(bào)道不斷增多。根據(jù)中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET)對(duì)2005-2017年臨床常見(jiàn)病原菌分離及耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌耐藥率及增長(zhǎng)率均居首位，2017年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南及美羅培南耐藥率均已大于60%，并且在多地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率大于80%，最高可達(dá)91.7%，已經(jīng)呈現(xiàn)耐藥暴發(fā)狀態(tài)，導(dǎo)致臨床治療困難，感染病死率增加[8]。世界衛(wèi)生組織已將對(duì)碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌列入對(duì)人類健康構(gòu)成最大威脅細(xì)菌的關(guān)鍵組中，從而優(yōu)先研究和開(kāi)發(fā)治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的方法[9]。由于抗菌藥物使用習(xí)慣的不同，同一種細(xì)菌在不同地區(qū)的耐藥表現(xiàn)和耐藥機(jī)制可能有差異，因此，實(shí)驗(yàn)室通過(guò)研究分析及時(shí)掌握本地區(qū)細(xì)菌的耐藥特點(diǎn)和規(guī)律，對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥有重要意義。

本研究的110株鮑曼不動(dòng)桿菌中，相對(duì)敏感菌只占22.7%，而多重耐藥菌和泛耐藥菌分別占38.2%和39.1%，后兩者合計(jì)占77.3%，說(shuō)明臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌中絕大部分菌株都是耐藥菌株。對(duì)3類不同耐藥性的菌株進(jìn)行藥敏結(jié)果分析，其中25株相對(duì)敏感菌對(duì)絕大部分藥物敏感。42株多重耐藥菌對(duì)多類抗菌藥物高度耐藥，除替加環(huán)素以外，對(duì)其余抗菌藥物耐藥率均大于55.0%，其中對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率均大于90.0%。43株泛耐藥菌對(duì)絕大部分抗菌藥物高度耐藥，其中包括妥布霉素、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、氨曲南和環(huán)丙沙星。這些結(jié)果提示，對(duì)臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，其抗感染治療方案的確定需慎重對(duì)待，必須綜合分析實(shí)驗(yàn)室、臨床科室等部門的信息再應(yīng)用。

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，包括：(1)產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶，如超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶等，從而對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥；(2)抗菌藥物作用靶位的改變，如產(chǎn)生16S rRNA 甲基化酶導(dǎo)致對(duì)氨基糖苷類耐藥；(3)細(xì)菌主動(dòng)外排系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)，adeABC是鮑曼不動(dòng)桿菌中主要和特有的多重耐藥外排泵，其中adeB起主要介導(dǎo)作用，主要介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥[10-11]。由于基因支持著細(xì)菌的基本構(gòu)造和性能，絕大部分情況下細(xì)菌的耐藥表型均受基因控制，因此，本研究對(duì)收集的菌株進(jìn)行了常見(jiàn)耐藥基因的檢測(cè)，以便了解本地區(qū)該類細(xì)菌常見(jiàn)耐藥基因攜帶情況，結(jié)果顯示，adeB耐藥基因的檢出率最高，為73.6%，提示本地區(qū)分離菌株的主動(dòng)外排系統(tǒng)過(guò)度表達(dá)是其產(chǎn)生耐藥性的原因之一。對(duì)不同耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因檢出結(jié)果進(jìn)行比較，多重耐藥菌的TEM、armA、adeB耐藥基因檢出率比相對(duì)敏感菌高；泛耐藥菌的TEM耐藥基因檢出率同樣比相對(duì)敏感菌高。以上結(jié)果提示，鮑曼不動(dòng)桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘀啬退幘赡芘c其攜帶TEM、armA、adeB耐藥基因有關(guān)，而成為泛耐藥菌可能與其攜帶TEM耐藥基因有關(guān)。鮑曼不動(dòng)桿菌一旦對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥，往往會(huì)對(duì)頭孢菌素類、青霉素類、喹諾酮類等抗菌藥物也耐藥，表現(xiàn)為多重耐藥，甚至泛耐藥[12]。本研究攜帶不同耐藥基因菌株的耐藥譜不完全相同，對(duì)大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率超過(guò)60.0%。在超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶基因TEM和PER檢出菌株中，除對(duì)替加環(huán)素外，攜帶基因TEM菌株對(duì)抗菌藥物耐藥率均比攜帶基因PER菌株耐藥率高，提示攜帶TEM基因的菌株更容易導(dǎo)致對(duì)抗菌藥物耐藥。因此，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果合理用藥，杜絕抗菌藥物的濫用，防止耐藥菌播散流行。

生物膜是構(gòu)成細(xì)菌侵襲力的重要因子，其在細(xì)菌的黏附、感染、耐藥性與耐藥基因的傳遞、逃避宿主免疫反應(yīng)等方面具有重要作用[13]。生物膜形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要許多因素協(xié)同作用，例如外膜蛋白A(OmpA)、blaPER-1、CsuA/BABCDE伴侶-菌絲菌毛組裝系統(tǒng)，以及鐵的吸收機(jī)制(鐵螯合分子、BasD和BauA)[14-15]。不同的生長(zhǎng)條件會(huì)影響生物膜的形成，如溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)成分和光照等。有研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌在28 ℃溫度條件下比在37 ℃溫度條件下的生物膜形成能力強(qiáng)，慢生長(zhǎng)的細(xì)菌并不會(huì)使其生物膜形成能力減弱[16]。本研究結(jié)果顯示，在決定鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成的因素中，除了bla-PER1基因以外，AbaI、Csu E 、Csu C、Csu D、Omp A、surA1、Pld、paaE基因的檢出率均較高(>65.0%)，表明大多數(shù)臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌具有潛在生物膜形成能力。而多重耐藥菌和泛耐藥菌的paaE生物膜基因檢出率比相對(duì)敏感菌高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明菌株攜帶paaE生物膜基因可能與其多重耐藥或者泛耐藥有關(guān)。

4 結(jié) 論

臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌中絕大多數(shù)菌株均具有不同程度耐藥性，應(yīng)引起臨床醫(yī)生重視，對(duì)這類細(xì)菌感染患者需根據(jù)藥敏結(jié)果合理用藥；本研究所有菌株中耐藥基因adeB的檢出率最高，提示本地區(qū)分離株的主動(dòng)外排系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)是其產(chǎn)生耐藥性的原因之一，多重耐藥菌最常檢出的耐藥基因是TEM、armA和adeB，泛耐藥菌中最常檢出的耐藥基因是TEM和adeB； 臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌可檢出多種生物膜基因，具有潛在生物膜形成能力，生物膜基因paaE的攜帶可能在菌株多重耐藥和泛耐藥菌中起一定作用。