3種實(shí)時(shí)熒光PCR儀對(duì)120份新型冠狀病毒檢測(cè)標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果比較*

黃玉蘭，韓聲付，曾林子，肯 布，張光慧，賈春燕，彭秀娟，楊小蓉△

(1.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.爐霍縣疾病預(yù)防控制中心，四川甘孜 626500；3.綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院/四川省精神衛(wèi)生中心檢驗(yàn)科,四川綿陽(yáng) 621000)

新型冠狀病毒屬于冠狀病毒科β屬，包括29 891個(gè)核苷酸，并編碼9 860個(gè)氨基酸，與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)同源性為82%[1]，其傳染性強(qiáng)于SARS-CoV[2-3]。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》，實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽(yáng)性為確診病例的病原學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)之一[4]。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有結(jié)果直觀，重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高和易操作等優(yōu)點(diǎn)[5]。然而，核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性也會(huì)受標(biāo)本質(zhì)量、運(yùn)輸、儲(chǔ)存條件、核酸檢測(cè)試劑性能及PCR儀等因素影響[6]。為了解實(shí)時(shí)熒光PCR儀對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果的影響，本研究擬對(duì)同一批標(biāo)本使用同一廠家、同一批號(hào)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑，在3種不同廠家生產(chǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行平行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，供儀器廠家和檢測(cè)機(jī)構(gòu)參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 120份咽拭子、尿液、糞便及唾液標(biāo)本采集自120例有臨床癥狀的新型冠狀病毒肺炎患者及其密切接觸者，其中咽拭子標(biāo)本81份，尿液標(biāo)本14份，唾液標(biāo)本14份，糞便標(biāo)本11份。所有標(biāo)本采集及運(yùn)輸均符合《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第五版)》[7]要求。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)核酸提取儀NatchS(圣湘生物科技股份有限公司，長(zhǎng)沙)；本試驗(yàn)選取國(guó)內(nèi)外3個(gè)廠家(編號(hào)為A、B、C)生產(chǎn)的不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光PCR儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。病毒標(biāo)本采集保存液(梓健生物科技有限公司，深圳，批號(hào):2020013001)；新型冠狀病毒核酸提取試劑盒(圣湘生物科技股份有限公司，長(zhǎng)沙，批號(hào)2019002、2020004)，靶基因位點(diǎn)為開(kāi)放讀取框(ORF)1ab和核殼蛋白(N)基因，其檢出限為200 copy/mL；TRIzol?Reagent試劑(Ambion公司,美國(guó)，批號(hào):15596026)。

1.3方法 試驗(yàn)操作均按照《新型冠狀病毒PCR實(shí)驗(yàn)室生物安全要求(第二版)》[8]。所有標(biāo)本預(yù)先放置到56 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，進(jìn)行30 min滅活處理。

1.3.1標(biāo)本前處理 (1)糞便標(biāo)本:用棉簽挑取黃豆粒大小糞便標(biāo)本至50 mL無(wú)菌離心管中，加入2 mL TRIzol?Reagent，混合均勻，靜置10 min后吸取600 μL上清液至1.5 mL離心管，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液待用。(2)唾液標(biāo)本:加入400 μL病毒保存液混合均勻后待用。(3)咽拭子標(biāo)本:混合均勻后待用。

1.3.2核酸提取 分別吸取200 μL前處理標(biāo)本，采用全自動(dòng)核酸提取儀NatchS及核酸提取試劑盒(圣湘生物科技股份有限公司，長(zhǎng)沙)，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行核酸提取。

1.3.3核酸擴(kuò)增 按照新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，分別采用A、B、C 3種實(shí)時(shí)熒光PCR儀，按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)程序，對(duì)120份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，若ORF1ab及N基因Ct值均<40，結(jié)果判為陽(yáng)性；若僅有單個(gè)基因Ct值<40，結(jié)果判為單基因陽(yáng)性；若ORF1ab及N基因Ct值均>40，結(jié)果判為陰性。

1.3.4質(zhì)量控制 每批次試驗(yàn)均帶有陰、陽(yáng)性對(duì)照及內(nèi)標(biāo)，陰、陽(yáng)性結(jié)果符合，且內(nèi)標(biāo)Ct值<40，則該批次檢測(cè)結(jié)果有效，反之需重復(fù)試驗(yàn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，3種檢測(cè)結(jié)果比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。通過(guò)計(jì)算Kappa值，分析檢測(cè)結(jié)果一致性:K≥0.75一致性好，0.40≤K<0.75一致性一般，K<0.40一致性差。

2 結(jié) 果

2.13種儀器基本情況 3種儀器生產(chǎn)日期、溫控方式、光源等存在差異，儀器基本情況比較見(jiàn)表1。

表1 3種儀器基本情況比較

2.23種儀器檢測(cè)結(jié)果 儀器A檢出陽(yáng)性51例，陰性40例，單基因陽(yáng)性29例(均為N基因陽(yáng)性)，檢出率為42.50%(51/120)。儀器B檢出陽(yáng)性42例，陰性54例，單基因陽(yáng)性24例(1例ORF1ab基因陽(yáng)性，其余N基因陽(yáng)性)，檢出率為35.00%(42/120)。儀器C檢出陽(yáng)性46例，陰性49例，單基因陽(yáng)性25例(均為N基因陽(yáng)性)，檢出率為38.33%(46/120)。

2.33種儀器檢測(cè)結(jié)果一致性 120例患者標(biāo)本，有95例通過(guò)3種儀器擴(kuò)增后檢測(cè)結(jié)果一致，其中陽(yáng)性41例，陰性40例，單基因陽(yáng)性14例，25例檢測(cè)結(jié)果不一致，見(jiàn)表2。由于研究使用的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)申明適用儀器為A，因此，將儀器A檢測(cè)結(jié)果作為參照進(jìn)行比較，儀器B擴(kuò)增后有99例與儀器A結(jié)果一致，其中陽(yáng)性42例，陰性40例，單基因陽(yáng)性17例；儀器C擴(kuò)增后有106例與儀器A結(jié)果一致，其中陽(yáng)性46例，陰性40例，單基因陽(yáng)性20例。

表2 3種儀器檢測(cè)結(jié)果差異

2.4儀器A與儀器B檢測(cè)結(jié)果一致性比較 120例標(biāo)本運(yùn)用儀器A及儀器B擴(kuò)增后，儀器A檢出陽(yáng)性標(biāo)本51例，儀器B與儀器A一致的有42例，儀器B將其中8例檢測(cè)為單基因陽(yáng)性(1例ORF1ab陽(yáng)性，7例N基因陽(yáng)性)，1例檢測(cè)為陰性；進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，儀器A和儀器B檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩種儀器檢測(cè)結(jié)果間一致性一般(K=0.732)， 檢測(cè)結(jié)果一致性見(jiàn)表3。

表3 儀器A及儀器B擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果一致性比較(n)

2.5儀器A與儀器C檢測(cè)結(jié)果一致性比較 120例患者標(biāo)本采用儀器A及儀器C擴(kuò)增后，儀器A檢出陽(yáng)性51例，儀器C與儀器A一致的有46例，儀器C將其中5例檢測(cè)為單基因陽(yáng)性(均為N基因陽(yáng)性)；進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，儀器A和儀器C檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩種儀器檢測(cè)結(jié)果間一致性好(K=0.821)，檢測(cè)結(jié)果一致性見(jiàn)表4。

表4 儀器A及儀器C擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果一致性比較(n)

3 討 論

本研究采用的標(biāo)本類型為新型冠狀病毒肺炎確診患者及密切接觸者的咽拭子、糞便、尿液和唾液標(biāo)本，3種儀器均適合對(duì)不同標(biāo)本提取的核酸進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)采用的核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)上標(biāo)示適用儀器為儀器A，本研究?jī)H針對(duì)各儀器相應(yīng)型號(hào)進(jìn)行比較。

2020年1月9日，我國(guó)科研人員通過(guò)測(cè)序成功破譯出新型冠狀病毒全基因組序列，并提交在virologic.org網(wǎng)站和GenBank。隨后市面上各種檢測(cè)新型冠狀病毒的商品化試劑盒相繼面世，其中PCR方法由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)，目前已成為檢測(cè)新型冠狀病毒核酸的主要方法[9]。檢測(cè)靶標(biāo)主要有ORF1ab、N基因及包膜蛋白(E)基因上的特異性保守序列，也有少數(shù)商品試劑盒同時(shí)檢測(cè)刺突糖蛋白(S)基因，實(shí)驗(yàn)室針對(duì)新型冠狀病毒的核酸檢測(cè)應(yīng)至少包含最為保守及特異的ORF1ab及N基因[10-12]。內(nèi)源性檢測(cè)系統(tǒng)(內(nèi)標(biāo)，IC)主要用于對(duì)標(biāo)本采集、核酸提取及擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，避免外部因素造成假陰性結(jié)果[13-15]。本研究所用的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)目的基因?yàn)镺RF1ab及N基因，同時(shí)含有內(nèi)源性檢測(cè)系統(tǒng)，其最低檢出限為200 copy/mL，盡可能避免由于試劑靈敏度等原因?qū)x器檢出結(jié)果造成影響。

溫控模塊、熒光激發(fā)是實(shí)時(shí)熒光PCR儀的關(guān)鍵裝置，不同品牌儀器的溫控模塊及熒光激發(fā)系統(tǒng)有所不同。如果實(shí)時(shí)熒光PCR儀與試劑的匹配性不好，就可能會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果。本研究中所用試劑說(shuō)明書(shū)指明最適儀器為儀器A，與之檢測(cè)結(jié)果相比，運(yùn)用儀器B檢測(cè)結(jié)果一致性一般，運(yùn)用儀器C檢測(cè)結(jié)果一致性好。因此，在實(shí)際工作中，如果實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有配置與檢測(cè)試劑盒匹配的實(shí)時(shí)熒光PCR儀，那么應(yīng)運(yùn)用多種質(zhì)控手段確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

從軟件操作及結(jié)果分析來(lái)比較，儀器A和儀器B為中文操作界面，適應(yīng)人群更廣，特別是對(duì)基層人員更容易操作，便于分析。而儀器C的全英文操作界面對(duì)操作人員英文水平有一定要求，且在結(jié)果分析時(shí)，與前兩者相比不能同時(shí)選擇3個(gè)通道查看結(jié)果，操作上較為復(fù)雜。值得注意的是，由于本研究試劑盒選擇FAM(ORF1ab)、ROX(N基因)、HEX(內(nèi)標(biāo))通道進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為470～510、580～620、530～565 nm，而儀器C僅有與HEX通道波長(zhǎng)相近的VIC通道，其波長(zhǎng)為533～580 nm，因此與測(cè)定N基因的ROX通道波長(zhǎng)有交叉，影響結(jié)果判定，因此，需要通過(guò)顏色補(bǔ)償校準(zhǔn)ROX和HEX通道，修正內(nèi)標(biāo)和N基因之間的干擾。

實(shí)時(shí)熒光PCR儀是精密復(fù)雜的儀器，電子元件的性能也會(huì)隨著使用年限增加而逐漸老化，影響檢測(cè)結(jié)果。本研究中使用的儀器C為2012年購(gòu)置，未進(jìn)行定期校正，可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，定期對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行校正非常必要。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光PCR儀檢測(cè)新型冠狀病毒肺炎標(biāo)本結(jié)果比較分析，3種儀器檢測(cè)結(jié)果和檢測(cè)一致性存在一定差異，提示廠家需進(jìn)一步優(yōu)化儀器性能，同時(shí)各檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)按照要求對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行校準(zhǔn)維護(hù)，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。