rhES結合3D-CRT治療對食管癌患者癥狀改善、血清sMICA及組織相關蛋白表達的影響*

余 磊，楊學為，蘇欣宇

(1.泰州市人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇泰州 225300；2.泰州市人民醫(yī)院婦科，江蘇泰州 225300；3.淮安市第二人民醫(yī)院放療科，江蘇淮安 223002)

食管癌是全球十大高發(fā)的惡性腫瘤之一。我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，因食管癌死亡人數(shù)占全球死亡人數(shù)的50%以上[1]。傳統(tǒng)的放射治療受腫瘤周圍正常組織的限制，病灶放射劑量不足，局部控制率低，患者的耐受性差，治療后食管癌患者的近5年生存率不足20%[2]。三維適形放射(3D-CRT)利用CT數(shù)據(jù)重建腫瘤結構，對病灶處精準放射，并通過調(diào)節(jié)不同靶區(qū)的放射劑量，減少對周圍正常組織的損傷，可有效地控制局部復發(fā)率，但對已經(jīng)發(fā)生遠處轉移的病灶治療效果不明顯。重組人血管內(nèi)皮抑制素(rhES)是我國自主研發(fā)、擁有獨立知識產(chǎn)權的抗腫瘤藥物，能抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖，阻斷營養(yǎng)物質的傳輸，誘導細胞的凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長與遷移。近年來，有研究表明rhES聯(lián)合化療治療食管癌效果較好[3]。細胞間質上皮轉換因子(c-met)作為原癌基因可促進新生血管生成，促進腫瘤生長、遷移、進展，有Meta分析表明c-met過表達可作為預測食管癌發(fā)生的獨立危險因素[4]。Stathmin是位于細胞質的微管解聚蛋白，參與微管、紡錘體形成和組裝，與細胞分裂增殖、運動功能等密切相關，組織相容性復合體Ⅰ類鏈相關蛋白A(sMICA)可與Ⅰ類鏈相關蛋白A(MICA)結合從而減弱其抗腫瘤作用，造成腫瘤免疫逃逸，既往研究表明Stathmin、MICA水平與食管癌TNM分期相關[5]。為進一步探究rhES聯(lián)合3D-CRT治療食管癌患者對Stathmin、c-met、sMICA表達，以及對患者癥狀改善、生存曲線的影響，本研究選取112例患者進行前瞻性研究，旨在為臨床診斷治療食管癌和開發(fā)新藥提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年7月至2014年8月泰州市人民醫(yī)院收治的食管癌患者112例為研究對象，納入標準：(1)綜合食管影像、臨床癥狀及病理學檢查確診為食管癌患者；(2)未發(fā)生遠處轉移者；(3)卡氏功能狀態(tài)評分標準(KPS)評分不低于60分者；(4)預計生存時間不低于6個月者；(5)所有患者均知曉本研究所涉及治療可能存在的風險，并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他腫瘤者；(2)有放療禁忌證者；(3)中途退出研究的患者，隨訪過程中失訪者。采用隨機數(shù)字表法將所有研究對象分為對照組和研究組，每組56例。對照組中男29例，女27例；年齡30～74歲，平均(44.31±2.67)歲；體質量指數(shù)(BMI)為(21.21±2.81)kg/m2；鱗癌46例，腺癌10例；Ⅱ期8例，Ⅲ期34例，Ⅳ期14例。研究組中男27例，女29例；年齡30～72歲，平均(43.54±5.12)歲；BMI為(21.65±2.41)kg/m2；鱗癌48例，腺癌8例；Ⅱ期9例，Ⅲ期32例，Ⅳ期15例。兩組患者的年齡、性別比例、BMI、病理類型、臨床分期等臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究取得泰州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準后進行。

1.2方法 對照組采取單獨3D-CRT治療方案。操作步驟：(1)CT掃描，采用螺旋CT(廠家為荷蘭Philips 公司，型號為Brilliance 64排128層螺旋CT)對病變部位進行掃描，控制每層掃描厚度約5 mm，將掃描數(shù)據(jù)傳輸至治療計劃系統(tǒng)；(2)勾畫靶區(qū)，由至少2名臨床經(jīng)驗豐富的醫(yī)生綜合CT掃描數(shù)據(jù)、食管鏡像資料勾畫腫瘤靶區(qū)(GTV)、臨床靶區(qū)(CTV)及計劃靶區(qū)(PTV)。其中，GTV為腫瘤的原發(fā)病灶與轉移病灶的總和，GTV上下外擴0～2.0 cm，前后左右外擴0～0.5 cm得到CTV，CTV再向四周擴大0～0.5 cm即為PTV；(3)放射治療，依照PTV計算放射劑量，控制放射劑量為每次2.0 Gy，1 d 1次，每周5次，照射周期為6周。周邊器官劑量控制為雙肺V20≤30%，脊髓劑量最高45 Gy，心臟V40≤40%。

研究組采取rhES聯(lián)合3D-CRT治療方案。在3D-CRT治療開始當天靜脈滴注rhES(規(guī)格：15 mg×3 mL，國藥準字S20050088，山東先聲麥得津生物制藥有限公司)，具體步驟：將15 mg rhES加入500 mL生理鹽水中，調(diào)節(jié)靜脈滴注速度，控制每次滴注時間約為4 h，1 d 1次，連續(xù)給藥2周，停藥1周，之后再繼續(xù)重復給藥，3周/療程，治療2個療程。

1.3觀察指標

1.3.1臨床療效 病灶消失，且病灶維持4周不復發(fā)，定義為完全緩解(CR)；病灶縮小≥50%，且病灶維持4周不變大，定義為部分緩解(PR)；病灶縮小<50%，病灶增大>5%，維持4周，定義為穩(wěn)定(SD)；病灶增大<25%或有新病灶出現(xiàn)，定義為進展(PD)。病情緩解率=(CR例數(shù)+PR例數(shù))/總病例數(shù)×100%。

1.3.2生存質量 治療前后利用KPS評分標準從角色、軀體、情緒、社會、認知功能及總體癥狀6個方面評估患者的生存質量。評分采用百分制，0分代表死亡，100分代表正常，分值越高，生存質量越高。

1.3.3Stathmin、c-met、sMICA、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達 收集兩組患者治療前后癌組織標本，放置于4%的多聚甲醛溶液中，包埋于石蠟，采用免疫組織化學法分別檢測組織中的Stathmin、c-met、VEGF表達。同時，檢測健康人群正常組織中Stathmin、c-met、VEGF蛋白表達水平，分別以健康人群平均水平為臨界值，判斷兩組患者組織中Stathmin、c-met、VEGF蛋白表達陽性率，即檢測水平大于臨界值即為陽性。治療前后，抽取患者空腹狀態(tài)下的外周靜脈血5 mL，2 500 r/min離心10～15 min，取上清液，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清中sMICA水平。

1.3.4隨訪 采用電話、網(wǎng)絡、門診復診等方式對所有患者每月進行隨訪，共隨訪60個月。用CT掃描病變部位及其周圍相鄰器官，觀察病灶的轉移和復發(fā)情況，計算治療后1、3、5年病灶轉移率和局部復發(fā)率，記錄每月死亡患者數(shù)，計算1、3、5年總體生存率，繪制生存曲線。

1.3.5不良反應發(fā)生率 觀察治療期間患者惡心嘔吐、放射性食管炎、白細胞下降、骨髓抑制等不良反應的發(fā)生情況，計算兩組不良反應發(fā)生率。

2 結 果

2.1兩組患者臨床療效比較 經(jīng)過治療，研究組的病情緩解率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床療效比較[n(%)]

2.2治療后兩組患者生存率比較 治療后，研究組1、3年生存率(89.29%、75.00%)與對照組(80.36%、58.93%)比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.269、1.734，P>0.05)，研究組5年生存率(55.36%)明顯高于對照組(35.71%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.467，P=0.019)。見圖1。

圖1 兩組患者生存率比較

2.3治療前后生存質量評分比較 治療前，兩組五大功能評分及總體癥狀評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后，兩組五大功能評分均明顯升高，總體癥狀評分均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且研究組五大功能評分均明顯高于對照組，總體癥狀評分明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2～4。

表2 兩組治療前后社會功能、軀體功能比較分)

表3 兩組治療前后角色功能、情緒功能比較分)

表4 兩組治療前后認知功能、總體癥狀比較分)

2.4治療前后兩組Stathmin、c-met、sMICA、VEGF表達情況比較 治療前，研究組和對照組患者組織中Stathmin、c-met、VEGF蛋白及血清中sMICA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。檢測健康人正常組織中Stathmin、c-met、VEGF蛋白表達平均水平分別為2.40、3.55、1.20 μg/L，分別以此為臨界值，判斷兩組患者Stathmin、c-met、VEGF蛋白表達陽性率，即檢測水平大于臨界值即為陽性。治療后研究組中的Stathmin、c-met、VEGF表達水平及陽性率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后研究組血清sMICA明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5、6。

表5 兩組患者治療前后Stathmin、c-met、sMICA、VEGF表達水平比較

表6 兩組治療后組織中相關蛋白表達陽性情況比較[n(%)]

2.5兩組病灶遠處轉移及局部復發(fā)情況比較 治療后，研究組和對照組的1、3年的病灶遠處轉移率、局部復發(fā)率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；研究組的5年病灶遠處轉移率、局部復發(fā)率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表7。

表7 兩組遠處病灶轉移及局部復發(fā)情況比較[n(%)]

2.6兩組不良反應發(fā)生率比較 治療期間，兩組患者的不良反應發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表8。

表8 兩組治療期間不良反應發(fā)生情況比較[n(%)]

2.7兩組中典型食管癌患者檢查結果圖片 采用食管影像、臨床癥狀及病理學檢查等手段對食管癌患者最終進行確診，確診的典型病例圖片見圖1。

注：A為食管癌患者下段CT增強圖像；B為食管癌患者病灶分割；C為消化道造影；D為胃鏡檢查結果；E為氣管鏡檢查結果(→所指為瘺口)；F為Stathmin 在組織中的表達(×200)；G為c-met 在組織中的表達(×200)；H為VEGF在組織中的表達(×200)。圖1 典型食管癌患者檢查圖片結果

3 討 論

食管癌是一種全球高發(fā)的惡性腫瘤。近年來，食管癌的發(fā)病率及病死率呈逐年遞增的趨勢。手術及放化療等傳統(tǒng)的食管癌治療方法因局部控制率差、腫瘤易復發(fā)、患者痛苦等缺陷，限制了其臨床廣泛應用。3D-CRT通過三維模擬腫瘤結構，加大靶區(qū)的放射劑量，減少周圍正常組織的放射劑量，提高腫瘤的局部控制率，減輕周圍器官的損傷。但受影像技術、照射區(qū)域及患者耐受性等因素的影響，3D-CRT對遠處轉移的病灶治療效果不佳。1971年，F(xiàn)OLKMAN首次提出腫瘤的增殖、轉移與新生血管的形成存在密切的聯(lián)系，由此，開啟了全球對抗新生血管形成藥物治療腫瘤的研究。目前，全球已開發(fā)出數(shù)百種抗血管生成藥物，例如，貝伐珠單體、雷莫蘆單抗、尼達尼布等。rhES是我國自主研發(fā)的一種光譜抗血管形成藥物，對多種腫瘤均有療效。rhES能抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，阻隔內(nèi)皮細胞內(nèi)信號傳輸，切斷腫瘤細胞營養(yǎng)物質供給，下調(diào)促新血管生成因子基因，改變腫瘤內(nèi)微環(huán)境，誘導腫瘤細胞凋亡，最終抑制腫瘤細胞的生長、轉移與增殖。

李曉寧[6]的研究發(fā)現(xiàn)，3D-CRT聯(lián)合化療治療食管癌的有效率高于單用3D-CRT治療。表明單用放療可能不能完全殺死腫瘤細胞，放療結束后腫瘤細胞重新修復增殖，為進一步提高放療的效果，本研究通過聯(lián)合rhES與3D-CRT治療食管癌，結果顯示研究組的病情緩解率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后，兩組患者的KPS五大功能評分均升高，總體癥狀評分均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且研究組五大功能評分高于對照組、總體癥狀評分低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究組5年生存率明顯高于對照組，5年病灶遠處轉移率和局部復發(fā)率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？梢?，rhES聯(lián)合3D-CRT能有效抑制腫瘤細胞的生長、轉移，改善患者的生存質量。郝延璋等[7]用rhES聯(lián)合新輔助放化療和手術治療局部晚期直腸癌患者，2年局部復發(fā)率為7.5%，明顯低于未用新輔助放化療和手術治療的對照組(25.0%)，且亞組分析結果表明聯(lián)合治療在VEGF高表達的患者中療效更明顯。有Meta分析發(fā)現(xiàn)，rhES聯(lián)合化療治療晚期胃癌比單用化療效果好[8]，在另一項Meta分析中發(fā)現(xiàn)，在中晚期原發(fā)性肝癌治療中，rhES聯(lián)合TACE治療的近期療效優(yōu)于單用TACE[9]。一項用Walker-256癌性腹水注射法建立荷瘤Wistar大鼠模型的動物實驗發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用32P膠體與rhES治療比單用32P膠體或rhES抑制腫瘤生長效果更好[10]。以上研究中，rhES與其他療法聯(lián)合治療各種類型腫瘤均可取得較好療效，產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能在于，一方面，rhES能抑制新血管的形成，調(diào)控內(nèi)皮細胞蛋白的表達，抑制腫瘤細胞擴散；另一方面，rhES能重塑腫瘤微環(huán)境，誘導腫瘤細胞正?；徑饽[瘤細胞缺氧狀況，提高腫瘤細胞的放射敏感性，可與3D-CRT協(xié)同作用于病灶。

VEGF能促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，增加血管的通透性，加快腫瘤細胞的營養(yǎng)供給，加速腫瘤細胞的生長、增殖與轉移，高水平的血管生成與食管癌預后不良和高侵襲性表型有關，可能與趨化因子受體7通過激活NF-κB信號通路上調(diào)VEGF-A、VEGF-C等表達有關。另有一項動物實驗用Stattic聯(lián)合放療治療食管癌ECA109細胞建立的裸鼠移植瘤模型，Western blot結果顯示，其VEGF蛋白水平比單用放療治療明顯降低，提示Stattic作用機制可能與抑制VEFG蛋白表達有關[11]。sMICA是一種癌細胞凋亡過程中細胞表面MICA脫落形成的蛋白質分子，與腫瘤細胞的進展、惡化緊密關聯(lián)。sMICA能降低NKG2D的表達，抑制機體免疫細胞NK細胞及T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，促使腫瘤免疫逃逸[12]。一項Meta分析發(fā)現(xiàn)，MICA/B的表達與消化系統(tǒng)腫瘤生存率顯著相關，但與呼吸系統(tǒng)和女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的相關性不明確，MICA/B和sMICA/B可作為評估癌癥患者治療效果的指標[13]。微管屬于細胞骨架的重要組成部分，參與細胞內(nèi)信號傳遞、細胞分裂、細胞運動、物質運輸?shù)?，微管處于動態(tài)變化狀態(tài)以維持細胞正常功能活動，Stathmin作為一種微管解聚蛋白，能作用于細胞的有絲分裂過程，改變細胞周期，調(diào)控微管系統(tǒng)的動態(tài)平衡，促進癌細胞的發(fā)展、侵襲及轉移。有研究表明，Stathmin高表達是食管鱗狀細胞癌患者生存率低的獨立危險因素，并與采用多西紫杉醇進行新輔助化療的不良反應有一定相關性，其表達下調(diào)可增強食管鱗狀細胞癌對紫杉醇和放射治療的敏感性，可能與Stathmin抑制多西紫杉醇穩(wěn)定微絲微管的作用有關[14-16]。c-met是一種酪氨酸激酶受體，其表達水平受原癌基因c-met的調(diào)控。c-met主要作用于上皮細胞，c-met信號通路能誘導細胞擴散，促進血管生成，加速細胞的侵襲及轉移，與多種惡性腫瘤的生長、轉移及耐藥性有關[17]。有研究表明，干擾素刺激基因15(ISG15)在食管鱗狀細胞癌中表達水平上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)ISG15可影響c-met基因的表達，可能是通過c-met/Fyn/β-catenin基因途徑促進腫瘤生長[18]。

絕大多數(shù)腫瘤患者VEGF、sMICA、Stathmin、c-met均呈現(xiàn)異常高表達水平，這些因子均可能成為惡性腫瘤細胞治療中的關鍵靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前，研究組和對照組的Stathmin、c-met、VEGF表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后研究組組織中的Stathmin、c-met、VEGF表達水平及陽性率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？梢?，rhES聯(lián)合3D-CRT能有效降低食管癌患者VEGF、sMICA、Stathmin、c-met的表達，抑制腫瘤細胞的發(fā)展。此外，治療期間兩組患者的不良反應發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，安全性好。梁晶等[19]的研究表明，肺癌患者的sMICA和VEGF、基質金屬蛋白酶-7mRNA(MMP-7mRNA)共同參與構成肺癌病灶轉移微環(huán)境，經(jīng)手術或化療治療后患者血清MMP-7mRNA、sMICA和VEGF水平均有所降低，與本研究結果一致，可能原因為VEGF、sMICA合成增多可供給腫瘤生長所需的新生血管和深部所需營養(yǎng)物質，并影響MMPs水平加快內(nèi)皮遷移和基底膜溶解，本研究中VEGF、sMICA水平降低可能提示食管癌細胞遷移能力和生長速度得到有效控制。LI等[20]研究中通過構建Cox比例風險模型發(fā)現(xiàn)，生長因子顆粒素蛋白前體(PGRN)水平高的食管癌患者5年病死率是低水平PGRN患者的2倍，可能通過激活VEGF-C并在淋巴管生成中發(fā)揮一定作用，高水平的PGRN與淋巴結轉移、淋巴微血管密度增高、淋巴管間隙侵犯有關，PGRN誘導血管、淋巴管生成，上調(diào)VEGF水平，促進食管癌的發(fā)生、發(fā)展。rhES作為抗血管內(nèi)皮因子與放療聯(lián)合，可能通過降低PGRN和VEGF水平，減少腫瘤組織血管和淋巴管的生成，進而抑制腫瘤生長。Stathmin可能參與stat介導的中心體聚集，在乳腺癌相關的研究中表明，Stathmin敲除后可抑制上皮細胞增殖，導致上皮細胞有絲分裂時紡錘體定向紊亂，阻止子細胞正確定向、極性喪失和增殖失控，導致正常乳腺結構嚴重紊亂和腫瘤發(fā)生過程延遲，可作為藥物治療的靶點[21]，met基因擴增或c-met高表達與放療后總體生存率、CR率較低，局部控制率較差，無病生存期短相關[22]，本研究中rhES和3D-CRT治療后血清c-met和Stathmin水平的降低提示在聯(lián)合治療的作用下紊亂的腫瘤區(qū)域微環(huán)境恢復正?；蜈呌谡?。

4 結 論

rhES聯(lián)合3D-CRT治療食管癌患者能有效地降低食管癌患者血清中VEGF、sMICA、Stathmin、c-met的表達，抑制腫瘤細胞的生長、轉移，改善患者的生存質量，且并發(fā)癥少，安全性高，有望在臨床上推廣。