Cladosporium sp.AY-42固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化

文曉霞，李豪，魏溱，熊蘊琦，鄒偉

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644005)

纖維素是地球上最豐富的生物質(zhì)資源，同時也是天然的可再生資源，而纖維素酶可以水解纖維素為結(jié)構(gòu)簡單的葡萄糖進行有效轉(zhuǎn)化并加以利用[1]。纖維素酶是一種高效、安全的生物催化劑，在食品生產(chǎn)加工、包裝運輸中應(yīng)用廣泛[2]。纖維素酶的最適合酶解pH一般在4.5～6.0之間，溫度低于50 ℃，不利于纖維素酶活性的發(fā)揮[3]。纖維素酶按照功能分為三類：外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[4]。纖維素酶來源十分廣泛，細菌、真菌、放線菌等都能產(chǎn)生纖維素酶。植物細胞細胞壁的主要成分為纖維素，纖維素酶可以降解其纖維素，促進細胞活性成分有效溶出，提高提取率[5,6]。目前，纖維素酶已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，如發(fā)酵食品工業(yè)、果蔬加工產(chǎn)業(yè)、榨油產(chǎn)業(yè)、茶葉加工產(chǎn)業(yè)、單細胞蛋白生產(chǎn)等[7]。通過纖維素復合酶解法，研究復合發(fā)酵調(diào)味品，增加了調(diào)味品風味的豐富度，提高了產(chǎn)率[8]。

秸稈是我國農(nóng)作物生產(chǎn)中的主要“廢棄物”，產(chǎn)量大、分布廣、種類多[9]。秸稈主要營養(yǎng)成分為木質(zhì)素、纖維素和半纖維素以及微量礦物質(zhì)元素[10]。纖維素酶生產(chǎn)主要有液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種方式，兩種生產(chǎn)方式各有優(yōu)缺點，目前均有工業(yè)應(yīng)用。固態(tài)發(fā)酵是菌株在含有少量游離水的培養(yǎng)基上生長并發(fā)酵產(chǎn)物的過程，其底物多為農(nóng)業(yè)廢棄物等，因此具有高產(chǎn)、低能耗及污染小等優(yōu)點[11]。Jagannath A等[12]優(yōu)化了醋酸桿菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件，最終酶活力達1.27 IU/mL。龔勇等[13]優(yōu)化了固態(tài)發(fā)酵纖維素酶霉菌的培養(yǎng)條件，最終CMC酶活力為89.892 U/mL，F(xiàn)PA酶活力為30.912 U/mL。陳曉萍等[14]使用響應(yīng)面法優(yōu)化了康寧木霉(Trichodermakoningii)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件，優(yōu)化了麩皮添加量、料水比及初始pH，最終FPA酶活提高了2.9倍。固態(tài)發(fā)酵適宜霉菌的生長，且固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶能力一般高于液體發(fā)酵，因此固態(tài)發(fā)酵法在纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)中有重要作用。

本研究以實驗室前期得到的突變株Cladosporiumsp. AY-42[15]作為出發(fā)菌株，以秸稈粉和麩皮之比作為碳源，對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，以期獲得產(chǎn)酶能力高的菌株，為該菌株的進一步應(yīng)用提供了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌株：Cladosporiumsp. AY-42，原始菌株Cladosporiumsp. B03現(xiàn)保存于四川省微生物資源平臺菌種保藏中心，編號為SICC 3.1199。

試劑與藥品：檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)、1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、DNS溶液、羧甲基纖維素鈉、NaCl、FeSO4、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、(NH4)2SO4、K2SO4、麩皮、秸稈粉等。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-250恒溫培養(yǎng)箱；TG-16醫(yī)用離心機 四川蜀科儀器有限公司；PHS-3C酸度計；YX280A型高壓蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-1F凈化工作臺；HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；V-1000可見分光光度計 翱藝儀器有限公司；SKY-2102C恒溫振蕩器 上海蘇坤實業(yè)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的制備

1.3.1 種子培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，去離子水1000 mL。

1.3.2 分離培養(yǎng)基

CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，瓊脂20 g，去離子水1000 mL。

1.3.3 麩皮培養(yǎng)基

麩皮15 g，蒸餾水10 mL，裝于150 mL三角瓶中滅菌后備用。

1.3.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

油菜秸稈粉3 g，麩皮2 g，料水比1∶1.5，(NH4)2SO40.2 g，裝于150 mL三角瓶中滅菌后備用。

1.4 實驗方法

1.4.1Cladosporiumsp. AY-42的麩曲種子培養(yǎng)

將斜面保存的菌株Cladosporiumsp. AY-42接種于分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，劃線2～3代活化后將菌株孢子用接種環(huán)挑取到麩皮培養(yǎng)基中，每次挑取3次。將接種后的麩皮培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每隔12 h振蕩培養(yǎng)基防止板結(jié)，至菌絲長滿培養(yǎng)基表面并且菌株產(chǎn)生大量孢子為佳。

1.4.2 粗酶液制備

將培養(yǎng)好的麩皮種子培養(yǎng)基按10%的接種量接種到滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，取2 g固態(tài)發(fā)酵物加入20 mL蒸餾水，在搖床中28 ℃、180 r/min振蕩1 h，然后過濾將濾液以5000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.4.3 酶活測定和葡萄糖標準曲線

1.4.3.1 羥甲基纖維素酶(CMC酶)活測定

4根25 mL比色管，1根作空白對照，4根管中都加入1.5 mL濃度為1%的CMC溶液，3根實驗管中加入0.5 mL粗酶液，空白管不加粗酶液，一起在50 ℃下反應(yīng)30 min，取出后都加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液后迅速與實驗管一起沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容到25 mL，540 nm下測定吸光值，計算酶活。

酶活定義：在一定條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量定義為一個酶活單位IU。

式中：m為葡萄糖的質(zhì)量，mg；1000為葡萄糖mg換算成μg；n為稀釋倍數(shù)；180為葡萄糖的摩爾質(zhì)量，mg；t為酶活反應(yīng)時間，min；0.5為換算成酶液1 mL。

1.4.3.2 葡萄糖標準曲線

配制1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，取8支比色管，依次編號為0，1，2……7，分別取葡萄糖標準液0，0.2，0.4，0.6……1.2，1.4 mL依次加入比色管中，然后依次加入2，1.8，1.6，1.4……0.8，0.6 mL蒸餾水(見表1)，使每個比色管體積為2 mL，再向每根比色管中加入1.5 mL DNS溶液，然后將8根比色管一起放入沸水中水浴10 min，立即取出比色管冷卻至室溫，再定容至25 mL，在540 nm下測定吸光值。以吸光值為縱坐標、葡萄糖濃度為橫坐標做實驗，采用Excel繪制葡萄糖的標準曲線。

表1 葡萄糖標準曲線測定表

1.4.4 固態(tài)培養(yǎng)基組成優(yōu)化

1.4.4.1 碳源對產(chǎn)酶的影響

對固態(tài)培養(yǎng)基中碳源進行優(yōu)化，將油菜秸稈粉∶麩皮分別設(shè)置為1∶0、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、0∶1共6組不同的比值，料水比為1∶1.5，(NH4)2SO4為0.2 g，種子培養(yǎng)基接種量為10%，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測定CMC酶活，探究最適的油菜秸稈粉與麩皮的比例。

1.4.4.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

探究不同氮源對產(chǎn)酶的影響，氮源分別為蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4NO3、酵母粉、NH4Cl、尿素，油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶1.5，種子培養(yǎng)基接種量為10%，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測定CMC酶活，確定固態(tài)發(fā)酵的最佳氮源。

1.4.4.3 氮源濃度對產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶1.5，種子培養(yǎng)基接種量為10%，(NH4)2SO4添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測定CMC酶活，探究氮源濃度對菌株產(chǎn)酶的影響。

1.4.5 固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.5.1 料水比對產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，(NH4)2SO4添加量為2%，種子培養(yǎng)基接種量為10%，料水比分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測定CMC酶活。

1.4.5.2 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶2，(NH4)2SO4為0.3 g，種子培養(yǎng)基接種量為10%，在25，28，30，33，35 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測定CMC酶活，確定最適的發(fā)酵溫度。

1.4.5.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶2，(NH4)2SO4為0.3 g，種子培養(yǎng)基接種量分別為5%、7.5%、10%、12.5%、15%，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測定CMC酶活。

1.4.5.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶2，(NH4)2SO4為0.3 g，種子培養(yǎng)基接種量為7.5%，在30 ℃下分別恒溫培養(yǎng)1，2，3，4，5，6，7 d后測定CMC酶活。

1.4.6 固態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇料水比、溫度、發(fā)酵時間進行響應(yīng)面優(yōu)化，進一步探究培養(yǎng)條件對固態(tài)產(chǎn)酶的影響。采用Box-Behnken設(shè)計，對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化，實驗設(shè)計見表2和表3。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計因素水平表

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計表

用Box-Behnken設(shè)計進行響應(yīng)面分析，根據(jù)實驗結(jié)果使用Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)分析，建立響應(yīng)面模型，得最佳的培養(yǎng)條件。為了檢驗響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的準確性，使用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)菌株，將實驗值與預(yù)測值進行對比分析，驗證模型是否準確。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

每個樣品固態(tài)發(fā)酵均做3次平行實驗，采用Excel進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 9.0和SPSS 23進行數(shù)據(jù)分析。測定結(jié)果以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)采用ANOVA進行Duncan差異分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對產(chǎn)酶的影響

以不同的油菜秸稈粉與麩皮之比為碳源，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源對產(chǎn)酶的影響

由圖1可知，單獨以油菜秸稈粉和麩皮為碳源時菌株產(chǎn)酶能力不太高。麩皮中含有一定的微生物生長因子，是一種常見的輔助碳源，適當?shù)靥砑欲熎つ軌蛱岣弋a(chǎn)酶能力。當油菜秸稈粉與麩皮比為3∶2時菌株產(chǎn)酶能力最高，此時其CMC酶活達(5.18±0.02) IU，超過這一比例時產(chǎn)酶能力降低，原因可能是過多的麩皮會增加培養(yǎng)基粘性從而影響培養(yǎng)基的透氣性，因此選擇油菜秸稈粉與麩皮的比為3∶2作為碳源。

2.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

不同的氮源種類對菌株固態(tài)發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 氮源對產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，菌株利用(NH4)2SO4作為氮源時酶活最高，CMC酶活為(5.27±0.03) IU?？傮w來講，菌株產(chǎn)酶對無機氮的利用高于有機氮，實驗使用尿素作為氮源時酶活較低，尿素能增加培養(yǎng)基的pH值，影響菌株生長產(chǎn)酶。因此，選擇(NH4)2SO4作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

2.3 氮源濃度對產(chǎn)酶的影響

以(NH4)2SO4為氮源，不同氮源濃度對菌株固態(tài)發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 氮源濃度對產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，隨著(NH4)2SO4含量的增加，酶活逐漸增大，2%、3%含量下酶活相差不明顯，從成本考慮，以添加量少的為最佳添加量。當超過3%后菌株產(chǎn)酶能力下降，這可能是因為(NH4)2SO4的添加量過大會引起培養(yǎng)基pH的變化，阻礙菌體生長產(chǎn)酶。因此，選擇2%的(NH4)2SO4含量為氮源濃度。

2.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

圖4 不同培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響

2.4.1 料水比對產(chǎn)酶的影響

由圖4中A可知，最適的料水比為1∶2，在此條件下菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CMC酶活為(6.80±0.05) IU。固態(tài)發(fā)酵的特點是微生物在不含游離水但濕潤的培養(yǎng)物中發(fā)酵。此時料水比對菌株的生長有較大影響，水分含量過大會導致培養(yǎng)基透氣性不足，影響菌株生長，產(chǎn)酶會降低。水含量過低會影響菌株利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，導致菌株生長受阻。因此，選擇料水比為1∶2進行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.4.2 溫度對產(chǎn)酶的影響

由圖4中B可知，溫度會影響細胞膜的流動性和微生物體內(nèi)生物大分子的活性。溫度升高，微生物體內(nèi)各種生化反應(yīng)都會加速，微生物的生長和代謝產(chǎn)物也會增加。但是過高的溫度會使生物體內(nèi)活性物質(zhì)失活，影響微生物的生長和代謝。由4中圖B可知，菌株AY-42在30 ℃之前隨著溫度的增加產(chǎn)酶能力增加，30 ℃后隨著溫度增加產(chǎn)酶能力降低。在30 ℃時菌株CMC酶活力為(7.51±0.05) IU，因此選擇30 ℃作為固態(tài)發(fā)酵最適溫度。

2.4.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

由圖4中C可知，接種量對菌株AY-42產(chǎn)酶影響較小，在接種量超過7.5%后菌株產(chǎn)酶變化不大。由實驗過程分析可知，枝孢菌屬為霉菌，在合適的條件下生長能力較強，因此即使接種量較小時菌株也能快速地生長達到與接種量較多的生物量水平。

2.4.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

由圖4中D可知，菌株在1～4 d時隨著時間的增加酶活增加，第4天時CMC酶活達(8.12±0.07) IU，4 d后酶活降低，第5天的酶活下降較多。菌株生長過程中產(chǎn)酶量會隨著菌株生長而積累，達到最高值后，隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，產(chǎn)酶減少，最終隨著微生物自身的死亡酶活力進一步降低。由實驗結(jié)果可知，最適發(fā)酵時間為4 d。

2.5 培養(yǎng)條件的響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素分析結(jié)果，因為接種量對產(chǎn)酶影響不大，因此選擇對菌株產(chǎn)酶影響較大的因素料水比、溫度和培養(yǎng)時間進行進一步優(yōu)化。利用Box-Behnken設(shè)計進行響應(yīng)面設(shè)計，根據(jù)實驗結(jié)果使用Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)分析，建立響應(yīng)面模型，實驗結(jié)果見表4；回歸方程的方差分析見表5；響應(yīng)面交互作用圖見圖5。

表4 Box-Behnken設(shè)計表

續(xù) 表

表5 回歸方程方差分析表

圖5 響應(yīng)面交互作用圖

使用Design-Expert軟件，對 Box-Behnken設(shè)計組合實驗結(jié)果進行響應(yīng)面回歸分析，得到固態(tài)發(fā)酵時菌株AY-42產(chǎn)纖維素酶酶活與A料水比、B溫度、C時間之間的三元二次回歸方程：Y=8.07-0.45A-0.51B-0.28C-0.18AB-0.70AC-0.67BC-0.89A2-1.38B2-0.57C2。

由表5可知，實驗所用模型P<0.0001，達到極顯著，說明方程擬合良好。失擬項P值為0.1045>0.05，不顯著，表明在實驗參數(shù)范圍內(nèi)，模型合理，可以用來推測和分析預(yù)處理實驗結(jié)果。方程的復相關(guān)系數(shù)R2=0.9863，說明擬合良好，實驗誤差較小。方程A2、B2、C2的系數(shù)為負數(shù)，說明該方程的拋物面開口朝下，在實驗值取值內(nèi)有極大值，可以得到最佳的培養(yǎng)條件組合。

響應(yīng)面的立體曲面圖的傾斜度越高，說明兩因素的交互作用越明顯。由圖5可知，溫度與時間和料水比與溫度的立體曲面傾斜度較大，說明因素間的交互作用較明顯，料水比與時間的立體曲面較緩和，表明因素間的交互作用不明顯。由此可知，酶活對時間的響應(yīng)小于溫度和料水比的。

2.6 結(jié)果驗證

根據(jù)實驗結(jié)果分析所得的三元二次回歸方程，使用Design-Expert軟件對回歸方程求解，得到最佳的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為料水比1∶1.88，溫度29.66 ℃，發(fā)酵時間4 d，實驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測酶活最大值為8.11 IU。最終根據(jù)實際條件修正最優(yōu)培養(yǎng)條件為料水比1∶1.8，溫度29 ℃，發(fā)酵時間4 d。以最終優(yōu)化的培養(yǎng)條件固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌株，3組平行培養(yǎng)，測定菌株的CMC酶活依次為8.25，8.12，8.16 IU，平均值為(8.17±0.05) IU。實驗值與預(yù)測值基本吻合，說明模型選用得當。經(jīng)優(yōu)化，培養(yǎng)菌株AY-42固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶纖維素酶活由(5.18±0.02) IU提高到(8.17±0.05) IU，酶活力提高了57.72%。

3 結(jié)果與討論

隨著纖維素酶的深入研究，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、飼料、生物質(zhì)能開發(fā)、能源及環(huán)保等多個領(lǐng)域中，因此，纖維素酶的生產(chǎn)具有廣闊的市場[16,17]。本研究對高產(chǎn)纖維素酶菌株Cladosporiumsp. AY-42固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示：通過單因素優(yōu)化確定了培養(yǎng)基的最適碳源為油菜秸稈粉∶麩皮3∶2，最適氮源為(NH4)2SO4以及最適氮源濃度為2%。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件通過單因素優(yōu)化確定最佳料水比為1∶2，最適發(fā)酵溫度為30 ℃，最適培養(yǎng)時間為4 d，接種量對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶影響不大。對料水比、溫度、時間進行響應(yīng)面優(yōu)化分析，得到最佳的培養(yǎng)條件組合為料水比1∶1.8，溫度29 ℃，發(fā)酵時間4 d。以最終優(yōu)化的培養(yǎng)條件固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌株，纖維素酶活由(5.18±0.02) IU提高到(8.17±0.05) IU，酶活力提高了57.72%。

本團隊前期對枝孢菌AY-42液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件進行了優(yōu)化研究，優(yōu)化后CMC酶活為(4.20±0.06) IU[18]，固態(tài)發(fā)酵是液態(tài)產(chǎn)酶水平的1.95倍。劉佳[19]對比了毛殼菌M6液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的差異，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶是液態(tài)的2.25倍，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶明顯優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵。Herculano等[20]利用棕櫚仁餅做底物，使用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵纖維素酶為244.53 U/g。本研究使用油菜秸稈粉進行固態(tài)發(fā)酵，菌株AY-42的生長旺盛,產(chǎn)酶能力較高，說明枝孢菌屬真菌也適用于固態(tài)發(fā)酵。目前關(guān)于枝孢菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶還未見研究，本實驗是首次報道該菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。

菌株Cladosporiumsp.AY-42應(yīng)用于纖維素酶的生產(chǎn)還需要進行很多的研究。由于本實驗只研究了菌株的粗酶酶活，未對纖維素酶進行分離純化，后續(xù)應(yīng)該進一步研究菌株產(chǎn)纖維素酶的分離純化，以期獲得純度更高的酶，為菌株應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。