Cladosporium sp.AY-42固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化

文曉霞，李豪，魏溱，熊蘊(yùn)琦，鄒偉

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005)

纖維素是地球上最豐富的生物質(zhì)資源，同時(shí)也是天然的可再生資源，而纖維素酶可以水解纖維素為結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的葡萄糖進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化并加以利用[1]。纖維素酶是一種高效、安全的生物催化劑，在食品生產(chǎn)加工、包裝運(yùn)輸中應(yīng)用廣泛[2]。纖維素酶的最適合酶解pH一般在4.5～6.0之間，溫度低于50 ℃，不利于纖維素酶活性的發(fā)揮[3]。纖維素酶按照功能分為三類：外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[4]。纖維素酶來源十分廣泛，細(xì)菌、真菌、放線菌等都能產(chǎn)生纖維素酶。植物細(xì)胞細(xì)胞壁的主要成分為纖維素，纖維素酶可以降解其纖維素，促進(jìn)細(xì)胞活性成分有效溶出，提高提取率[5,6]。目前，纖維素酶已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，如發(fā)酵食品工業(yè)、果蔬加工產(chǎn)業(yè)、榨油產(chǎn)業(yè)、茶葉加工產(chǎn)業(yè)、單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)等[7]。通過纖維素復(fù)合酶解法，研究復(fù)合發(fā)酵調(diào)味品，增加了調(diào)味品風(fēng)味的豐富度，提高了產(chǎn)率[8]。

秸稈是我國(guó)農(nóng)作物生產(chǎn)中的主要“廢棄物”，產(chǎn)量大、分布廣、種類多[9]。秸稈主要營(yíng)養(yǎng)成分為木質(zhì)素、纖維素和半纖維素以及微量礦物質(zhì)元素[10]。纖維素酶生產(chǎn)主要有液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種方式，兩種生產(chǎn)方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，目前均有工業(yè)應(yīng)用。固態(tài)發(fā)酵是菌株在含有少量游離水的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并發(fā)酵產(chǎn)物的過程，其底物多為農(nóng)業(yè)廢棄物等，因此具有高產(chǎn)、低能耗及污染小等優(yōu)點(diǎn)[11]。Jagannath A等[12]優(yōu)化了醋酸桿菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件，最終酶活力達(dá)1.27 IU/mL。龔勇等[13]優(yōu)化了固態(tài)發(fā)酵纖維素酶霉菌的培養(yǎng)條件，最終CMC酶活力為89.892 U/mL，F(xiàn)PA酶活力為30.912 U/mL。陳曉萍等[14]使用響應(yīng)面法優(yōu)化了康寧木霉(Trichodermakoningii)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件，優(yōu)化了麩皮添加量、料水比及初始pH，最終FPA酶活提高了2.9倍。固態(tài)發(fā)酵適宜霉菌的生長(zhǎng)，且固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶能力一般高于液體發(fā)酵，因此固態(tài)發(fā)酵法在纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)中有重要作用。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期得到的突變株Cladosporiumsp. AY-42[15]作為出發(fā)菌株，以秸稈粉和麩皮之比作為碳源，對(duì)其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得產(chǎn)酶能力高的菌株，為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用提供了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)菌株：Cladosporiumsp. AY-42，原始菌株Cladosporiumsp. B03現(xiàn)保存于四川省微生物資源平臺(tái)菌種保藏中心，編號(hào)為SICC 3.1199。

試劑與藥品：檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)、1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、DNS溶液、羧甲基纖維素鈉、NaCl、FeSO4、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、(NH4)2SO4、K2SO4、麩皮、秸稈粉等。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-250恒溫培養(yǎng)箱；TG-16醫(yī)用離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)；YX280A型高壓蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)；HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；V-1000可見分光光度計(jì) 翱藝儀器有限公司；SKY-2102C恒溫振蕩器 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的制備

1.3.1 種子培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，去離子水1000 mL。

1.3.2 分離培養(yǎng)基

CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，瓊脂20 g，去離子水1000 mL。

1.3.3 麩皮培養(yǎng)基

麩皮15 g，蒸餾水10 mL，裝于150 mL三角瓶中滅菌后備用。

1.3.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

油菜秸稈粉3 g，麩皮2 g，料水比1∶1.5，(NH4)2SO40.2 g，裝于150 mL三角瓶中滅菌后備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1Cladosporiumsp. AY-42的麩曲種子培養(yǎng)

將斜面保存的菌株Cladosporiumsp. AY-42接種于分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，劃線2～3代活化后將菌株孢子用接種環(huán)挑取到麩皮培養(yǎng)基中，每次挑取3次。將接種后的麩皮培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每隔12 h振蕩培養(yǎng)基防止板結(jié)，至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面并且菌株產(chǎn)生大量孢子為佳。

1.4.2 粗酶液制備

將培養(yǎng)好的麩皮種子培養(yǎng)基按10%的接種量接種到滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，取2 g固態(tài)發(fā)酵物加入20 mL蒸餾水，在搖床中28 ℃、180 r/min振蕩1 h，然后過濾將濾液以5000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.4.3 酶活測(cè)定和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.3.1 羥甲基纖維素酶(CMC酶)活測(cè)定

4根25 mL比色管，1根作空白對(duì)照，4根管中都加入1.5 mL濃度為1%的CMC溶液，3根實(shí)驗(yàn)管中加入0.5 mL粗酶液，空白管不加粗酶液，一起在50 ℃下反應(yīng)30 min，取出后都加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液后迅速與實(shí)驗(yàn)管一起沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容到25 mL，540 nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算酶活。

酶活定義：在一定條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量定義為一個(gè)酶活單位IU。

式中：m為葡萄糖的質(zhì)量，mg；1000為葡萄糖mg換算成μg；n為稀釋倍數(shù)；180為葡萄糖的摩爾質(zhì)量，mg；t為酶活反應(yīng)時(shí)間，min；0.5為換算成酶液1 mL。

1.4.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取8支比色管，依次編號(hào)為0，1，2……7，分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0，0.2，0.4，0.6……1.2，1.4 mL依次加入比色管中，然后依次加入2，1.8，1.6，1.4……0.8，0.6 mL蒸餾水(見表1)，使每個(gè)比色管體積為2 mL，再向每根比色管中加入1.5 mL DNS溶液，然后將8根比色管一起放入沸水中水浴10 min，立即取出比色管冷卻至室溫，再定容至25 mL，在540 nm下測(cè)定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)做實(shí)驗(yàn)，采用Excel繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定表

1.4.4 固態(tài)培養(yǎng)基組成優(yōu)化

1.4.4.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

對(duì)固態(tài)培養(yǎng)基中碳源進(jìn)行優(yōu)化，將油菜秸稈粉∶麩皮分別設(shè)置為1∶0、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、0∶1共6組不同的比值，料水比為1∶1.5，(NH4)2SO4為0.2 g，種子培養(yǎng)基接種量為10%，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測(cè)定CMC酶活，探究最適的油菜秸稈粉與麩皮的比例。

1.4.4.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

探究不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，氮源分別為蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4NO3、酵母粉、NH4Cl、尿素，油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶1.5，種子培養(yǎng)基接種量為10%，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測(cè)定CMC酶活，確定固態(tài)發(fā)酵的最佳氮源。

1.4.4.3 氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶1.5，種子培養(yǎng)基接種量為10%，(NH4)2SO4添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測(cè)定CMC酶活，探究氮源濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.4.5 固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.5.1 料水比對(duì)產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，(NH4)2SO4添加量為2%，種子培養(yǎng)基接種量為10%，料水比分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測(cè)定CMC酶活。

1.4.5.2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶2，(NH4)2SO4為0.3 g，種子培養(yǎng)基接種量為10%，在25，28，30，33，35 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測(cè)定CMC酶活，確定最適的發(fā)酵溫度。

1.4.5.3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶2，(NH4)2SO4為0.3 g，種子培養(yǎng)基接種量分別為5%、7.5%、10%、12.5%、15%，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)4 d后測(cè)定CMC酶活。

1.4.5.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基為油菜秸稈粉∶麩皮為3∶2，料水比為1∶2，(NH4)2SO4為0.3 g，種子培養(yǎng)基接種量為7.5%，在30 ℃下分別恒溫培養(yǎng)1，2，3，4，5，6，7 d后測(cè)定CMC酶活。

1.4.6 固態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料水比、溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，進(jìn)一步探究培養(yǎng)條件對(duì)固態(tài)產(chǎn)酶的影響。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，對(duì)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2和表3。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立響應(yīng)面模型，得最佳的培養(yǎng)條件。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)菌株，將實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證模型是否準(zhǔn)確。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品固態(tài)發(fā)酵均做3次平行實(shí)驗(yàn)，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 9.0和SPSS 23進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行Duncan差異分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

以不同的油菜秸稈粉與麩皮之比為碳源，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖1可知，單獨(dú)以油菜秸稈粉和麩皮為碳源時(shí)菌株產(chǎn)酶能力不太高。麩皮中含有一定的微生物生長(zhǎng)因子，是一種常見的輔助碳源，適當(dāng)?shù)靥砑欲熎つ軌蛱岣弋a(chǎn)酶能力。當(dāng)油菜秸稈粉與麩皮比為3∶2時(shí)菌株產(chǎn)酶能力最高，此時(shí)其CMC酶活達(dá)(5.18±0.02) IU，超過這一比例時(shí)產(chǎn)酶能力降低，原因可能是過多的麩皮會(huì)增加培養(yǎng)基粘性從而影響培養(yǎng)基的透氣性，因此選擇油菜秸稈粉與麩皮的比為3∶2作為碳源。

2.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同的氮源種類對(duì)菌株固態(tài)發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，菌株利用(NH4)2SO4作為氮源時(shí)酶活最高，CMC酶活為(5.27±0.03) IU?？傮w來講，菌株產(chǎn)酶對(duì)無機(jī)氮的利用高于有機(jī)氮，實(shí)驗(yàn)使用尿素作為氮源時(shí)酶活較低，尿素能增加培養(yǎng)基的pH值，影響菌株生長(zhǎng)產(chǎn)酶。因此，選擇(NH4)2SO4作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

2.3 氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

以(NH4)2SO4為氮源，不同氮源濃度對(duì)菌株固態(tài)發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，隨著(NH4)2SO4含量的增加，酶活逐漸增大，2%、3%含量下酶活相差不明顯，從成本考慮，以添加量少的為最佳添加量。當(dāng)超過3%后菌株產(chǎn)酶能力下降，這可能是因?yàn)?NH4)2SO4的添加量過大會(huì)引起培養(yǎng)基pH的變化，阻礙菌體生長(zhǎng)產(chǎn)酶。因此，選擇2%的(NH4)2SO4含量為氮源濃度。

2.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

圖4 不同培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.4.1 料水比對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4中A可知，最適的料水比為1∶2，在此條件下菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CMC酶活為(6.80±0.05) IU。固態(tài)發(fā)酵的特點(diǎn)是微生物在不含游離水但濕潤(rùn)的培養(yǎng)物中發(fā)酵。此時(shí)料水比對(duì)菌株的生長(zhǎng)有較大影響，水分含量過大會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基透氣性不足，影響菌株生長(zhǎng)，產(chǎn)酶會(huì)降低。水含量過低會(huì)影響菌株利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)受阻。因此，選擇料水比為1∶2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.4.2 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4中B可知，溫度會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和微生物體內(nèi)生物大分子的活性。溫度升高，微生物體內(nèi)各種生化反應(yīng)都會(huì)加速，微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物也會(huì)增加。但是過高的溫度會(huì)使生物體內(nèi)活性物質(zhì)失活，影響微生物的生長(zhǎng)和代謝。由4中圖B可知，菌株AY-42在30 ℃之前隨著溫度的增加產(chǎn)酶能力增加，30 ℃后隨著溫度增加產(chǎn)酶能力降低。在30 ℃時(shí)菌株CMC酶活力為(7.51±0.05) IU，因此選擇30 ℃作為固態(tài)發(fā)酵最適溫度。

2.4.3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4中C可知，接種量對(duì)菌株AY-42產(chǎn)酶影響較小，在接種量超過7.5%后菌株產(chǎn)酶變化不大。由實(shí)驗(yàn)過程分析可知，枝孢菌屬為霉菌，在合適的條件下生長(zhǎng)能力較強(qiáng)，因此即使接種量較小時(shí)菌株也能快速地生長(zhǎng)達(dá)到與接種量較多的生物量水平。

2.4.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4中D可知，菌株在1～4 d時(shí)隨著時(shí)間的增加酶活增加，第4天時(shí)CMC酶活達(dá)(8.12±0.07) IU，4 d后酶活降低，第5天的酶活下降較多。菌株生長(zhǎng)過程中產(chǎn)酶量會(huì)隨著菌株生長(zhǎng)而積累，達(dá)到最高值后，隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，產(chǎn)酶減少，最終隨著微生物自身的死亡酶活力進(jìn)一步降低。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，最適發(fā)酵時(shí)間為4 d。

2.5 培養(yǎng)條件的響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素分析結(jié)果，因?yàn)榻臃N量對(duì)產(chǎn)酶影響不大，因此選擇對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較大的因素料水比、溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。利用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立響應(yīng)面模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4；回歸方程的方差分析見表5；響應(yīng)面交互作用圖見圖5。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)表

續(xù) 表

表5 回歸方程方差分析表

圖5 響應(yīng)面交互作用圖

使用Design-Expert軟件，對(duì) Box-Behnken設(shè)計(jì)組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到固態(tài)發(fā)酵時(shí)菌株AY-42產(chǎn)纖維素酶酶活與A料水比、B溫度、C時(shí)間之間的三元二次回歸方程：Y=8.07-0.45A-0.51B-0.28C-0.18AB-0.70AC-0.67BC-0.89A2-1.38B2-0.57C2。

由表5可知，實(shí)驗(yàn)所用模型P<0.0001，達(dá)到極顯著，說明方程擬合良好。失擬項(xiàng)P值為0.1045>0.05，不顯著，表明在實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)，模型合理，可以用來推測(cè)和分析預(yù)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9863，說明擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小。方程A2、B2、C2的系數(shù)為負(fù)數(shù)，說明該方程的拋物面開口朝下，在實(shí)驗(yàn)值取值內(nèi)有極大值，可以得到最佳的培養(yǎng)條件組合。

響應(yīng)面的立體曲面圖的傾斜度越高，說明兩因素的交互作用越明顯。由圖5可知，溫度與時(shí)間和料水比與溫度的立體曲面傾斜度較大，說明因素間的交互作用較明顯，料水比與時(shí)間的立體曲面較緩和，表明因素間的交互作用不明顯。由此可知，酶活對(duì)時(shí)間的響應(yīng)小于溫度和料水比的。

2.6 結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析所得的三元二次回歸方程，使用Design-Expert軟件對(duì)回歸方程求解，得到最佳的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為料水比1∶1.88，溫度29.66 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)酶活最大值為8.11 IU。最終根據(jù)實(shí)際條件修正最優(yōu)培養(yǎng)條件為料水比1∶1.8，溫度29 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d。以最終優(yōu)化的培養(yǎng)條件固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌株，3組平行培養(yǎng)，測(cè)定菌株的CMC酶活依次為8.25，8.12，8.16 IU，平均值為(8.17±0.05) IU。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值基本吻合，說明模型選用得當(dāng)。經(jīng)優(yōu)化，培養(yǎng)菌株AY-42固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶纖維素酶活由(5.18±0.02) IU提高到(8.17±0.05) IU，酶活力提高了57.72%。

3 結(jié)果與討論

隨著纖維素酶的深入研究，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、飼料、生物質(zhì)能開發(fā)、能源及環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域中，因此，纖維素酶的生產(chǎn)具有廣闊的市場(chǎng)[16,17]。本研究對(duì)高產(chǎn)纖維素酶菌株Cladosporiumsp. AY-42固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示：通過單因素優(yōu)化確定了培養(yǎng)基的最適碳源為油菜秸稈粉∶麩皮3∶2，最適氮源為(NH4)2SO4以及最適氮源濃度為2%。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件通過單因素優(yōu)化確定最佳料水比為1∶2，最適發(fā)酵溫度為30 ℃，最適培養(yǎng)時(shí)間為4 d，接種量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶影響不大。對(duì)料水比、溫度、時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，得到最佳的培養(yǎng)條件組合為料水比1∶1.8，溫度29 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d。以最終優(yōu)化的培養(yǎng)條件固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌株，纖維素酶活由(5.18±0.02) IU提高到(8.17±0.05) IU，酶活力提高了57.72%。

本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)枝孢菌AY-42液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，優(yōu)化后CMC酶活為(4.20±0.06) IU[18]，固態(tài)發(fā)酵是液態(tài)產(chǎn)酶水平的1.95倍。劉佳[19]對(duì)比了毛殼菌M6液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的差異，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶是液態(tài)的2.25倍，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶明顯優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵。Herculano等[20]利用棕櫚仁餅做底物，使用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵纖維素酶為244.53 U/g。本研究使用油菜秸稈粉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，菌株AY-42的生長(zhǎng)旺盛,產(chǎn)酶能力較高，說明枝孢菌屬真菌也適用于固態(tài)發(fā)酵。目前關(guān)于枝孢菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶還未見研究，本實(shí)驗(yàn)是首次報(bào)道該菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。

菌株Cladosporiumsp.AY-42應(yīng)用于纖維素酶的生產(chǎn)還需要進(jìn)行很多的研究。由于本實(shí)驗(yàn)只研究了菌株的粗酶酶活，未對(duì)纖維素酶進(jìn)行分離純化，后續(xù)應(yīng)該進(jìn)一步研究菌株產(chǎn)纖維素酶的分離純化，以期獲得純度更高的酶，為菌株應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。