環(huán)磷酰胺對百草枯中毒家兔肺過氧化損傷的干預(yù)作用

蔣昌華, 簡萬均, 符宜龍, 唐中建, 舒艾婭

(重慶市涪陵中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科, 重慶 408000)

百草枯是一種聯(lián)砒啶類高效除草劑，因其能在土壤中迅速鈍化，對環(huán)境污染較小，且除草效果好，在全球范圍內(nèi)被廣泛使用[1]。百草枯的毒性極高，無特效解毒藥，可經(jīng)消化道、呼吸道以及皮膚黏膜吸收，中毒后死亡率可高達60%～70%[2]。百草枯進入機體后可隨血液分布至各組織器官，引起全身多臟器功能損害。肺是百草枯的主要靶器官，肺泡上皮細胞存在百草枯特殊性轉(zhuǎn)運體，導(dǎo)致百草枯在肺組織內(nèi)大量聚集，繼而引起肺泡充血、水腫，最終引發(fā)不可逆的肺纖維化[3]。臨床上對于百草枯中毒尚無特異性解毒劑，主要采取對癥治療和給予激素、免疫抑制劑等藥物為主，但治療效果并不理想，病死率依然居高不下[4]。環(huán)磷酰胺屬于免疫調(diào)節(jié)類制品，能夠增強機體免疫力，緩解肺部炎癥反應(yīng)程度[5]。有研究[6]表明，環(huán)磷酰胺聯(lián)合糖皮質(zhì)激素沖擊治療能夠有效降低降低百草枯中毒患者的死亡率，但其作用機制尚不清楚。本文通過檢測百草枯中毒家兔血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)表達情況，探討環(huán)磷酰胺干預(yù)對血清細胞因子的影響，為環(huán)磷酰胺治療百草枯中毒的作用機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物:選取清潔級健康家兔40只，雌雄不限，月齡3～6個月，體重2.5～3.0kg。實驗動物購于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心，動物合格證號：SYXK(渝)2012-0001；家兔購入后單籠飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔開放，飲水自由、定時給予飼料，觀察動物情況，1周后將飲食、排泄以及精神狀況正常家兔納入研究備用。

1.2實驗試劑與藥品:20%百草枯溶液購于北京先正達公司，生理鹽水(H20054037)購于安徽雙鶴藥業(yè)，環(huán)磷酰胺(H14023686，0.2g/支)購于山西普德藥業(yè)，甲強龍(H20123319，0.5g/支)購于天津金耀藥業(yè)，TGF-β1檢測試劑盒購于深圳丹納赫公司，MDA、SOD檢測試劑盒購于南京建成生物研究所，XS2型酶標儀購自鉑金埃爾默儀器公司。

1.3動物造模及干預(yù):將40只家兔隨機分為對照組、模型組、甲強龍組、環(huán)磷酰胺+甲強龍組，每組10只。模型組、甲強龍組、環(huán)磷酰胺+甲強龍組根據(jù)動物體質(zhì)量按照50mg/kg劑量進行百草枯溶液灌胃染毒，對照組則給予相同劑量生理鹽水灌胃。動物染毒后24h開始干預(yù)治療，其中對照組和模型組動物按照3mL/kg劑量腹腔注射生理鹽水，甲強龍組按照0.4mg/kg劑量腹腔注射甲強龍，環(huán)磷酰胺+甲強龍組同時給予0.4mg/kg甲強龍和60mg/kg環(huán)磷酰胺；每日上午給藥，連續(xù)7d。

1.4標本采集與檢測:分別在干預(yù)治療1d、3d、5d、7d后經(jīng)耳緣靜脈采集血液標本3mL，靜置10min，3000r/min離心15min，吸取血清-80℃保存待檢。按照試劑盒說明書采用酶聯(lián)免疫法檢測血清TGF-β1水平，硫代巴比妥酸法測定血MDA水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。

2 結(jié) 果

2.1實驗動物情況:對照組動物在研究過程中活動自如，食水攝入正常，體質(zhì)量趨于穩(wěn)定。模型組動物染毒后1～3h后即逐步顯現(xiàn)出中毒癥狀，初表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、食水攝入量減少；染毒1d后食欲持續(xù)降低、口鼻可見淡紅色分泌物；染毒后3d后出現(xiàn)呼吸急促、流涎、腹瀉等癥狀。甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組治療過程中毒表現(xiàn)與模型組大致相同，如呼吸急促、食水攝入量減少、精神萎靡等，但甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組癥狀較輕、持續(xù)時間較短，治療后第5d后癥狀開始緩解，精神狀況有所改善，食欲逐漸恢復(fù)，呼吸也逐漸平穩(wěn)。

2.2各組兔不同時點血清TGF-β1水平比較:染毒后1d，模型組、甲強龍組、環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清TGF-β1水平均高于對照組(P<0.05)，而模型組、甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清TGF-β1水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d時，模型組血清中TGF-β1水平均顯著高于對照組(P<0.05)；甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清中TGF-β1水平明顯低于模型組(P<0.05)，但均顯著高于對照組(P<0.05)；環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清中TGF-β1水平均低于甲強龍組(P<0.05)，見表1。

表1 各組動物染毒后不同時點血清TGF-β1水平比較

2.3各組兔在不同時點血清MDA水平比較:染毒后1d，模型組、甲強龍組、環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清MDA水平均高于對照組(P<0.05)，而模型組、甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清MDA水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d時，模型組血清MDA水平均顯著高于對照組(P<0.05)；甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清MDA水平均低于模型組(P<0.05)，但又明顯高于對照組(P<0.05)；環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清MDA水平均顯著低于甲強龍組(P<0.05),見表2。

2.4各組兔在不同時點血清MDA、SOD水平比較:染毒后1d，模型組、甲強龍組、環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清SOD水平均低于對照組(P<0.05)，而模型組、甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清SOD水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d時，模型組血清SOD水平均明顯低于對照組(P<0.05)；甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清SOD水平高于模型組，但顯著低于對照組(P<0.05)；環(huán)磷酰胺+甲強龍組血清SOD水平均明顯高于甲強龍組(P<0.05)，見表3。

表2 各組動物染毒后不同時點血清MDA水平比較

表3 各組動物染毒后不同時點血清SOD水平比較

3 討 論

百草枯是一種觸殺型砒啶類除草劑，能夠阻斷植物細胞電子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，導(dǎo)致細胞內(nèi)氧自由基大量聚集，從而對接觸的綠色植物起殺滅作用[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，百草枯與內(nèi)源性聚胺類分子的結(jié)構(gòu)類似，肺泡上皮細胞存在聚胺類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運體，百草枯會在肺部逆濃度差吸收，肺組織中百草枯的蓄積濃度可達到血漿的80～90倍。一項關(guān)于百草枯中毒患者隨訪研究[9]發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒初期即使存在輕度肺損傷，也會造成肺部嚴重的彌散性功能障礙，甚至出現(xiàn)不可逆的肺纖維化。

TGF-β1是判斷組織纖維化程度的重要指標，主要由肺泡巨噬細胞和肺間質(zhì)細胞釋放，其過表達會導(dǎo)致成纖維細胞大量聚集，促進膠原蛋白的沉積，加快組織纖維化進程[10]。MDA是膜脂過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，能間接反映膜系統(tǒng)過氧化程度；SOD是生命體中重要活性物質(zhì)，能消除新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基，從而發(fā)揮抗氧化作用[11]。本研究顯示，模型組動物染毒后各時點血清TGF-β1和MDA水平均顯著升高，且SOD水平則明顯降低；且隨著時間的推移，血清TGF-β1和MDA呈升高趨勢，血清SOD水平則呈明顯降低趨勢。提示氧化應(yīng)激參與百草枯中毒的肺損傷過程，隨著中毒時間的推移，體內(nèi)超氧自由基集聚，導(dǎo)致肺過氧化損傷逐漸加重。

甲強龍是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，具有較強抗炎和免疫抑制作用，能夠提高機體對有害刺激的應(yīng)激能力，從而抑制纖維細胞活性，減輕肺纖維化進程[12]。環(huán)磷酰胺是一種免疫調(diào)節(jié)藥物，能夠緩解炎癥反應(yīng)，減少白細胞的表達，減輕肺部炎癥損傷。本研究結(jié)果顯示，甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組家兔在染毒后治療的第1d血清TGF-β1、MDA、SOD水平與模型組無明顯差異，可能是由于療程較短，尚不能有效扭轉(zhuǎn)百草枯所造成的毒性損傷。隨著時間的推移，甲強龍組和環(huán)磷酰胺+甲強龍組家兔血清TGF-β1、MDA水平逐步降低，血清SOD水平逐漸升高，說明在連續(xù)使用環(huán)磷酰胺和甲強龍治療后，體內(nèi)氧化-抗氧化平衡逐漸恢復(fù)，肺組織損傷也得到改善。環(huán)磷酰胺+甲強龍組家兔在治療第3d、5d、7d血清TGF-β1、MDA及SOD水平改善程度優(yōu)于甲強龍組，提示在甲強龍治療基礎(chǔ)上加用環(huán)磷酰胺能降低百草枯中毒導(dǎo)致的氧化反應(yīng)程度，減輕肺過氧化損傷，扭轉(zhuǎn)肺纖維化病情。

綜上所述，環(huán)磷酰胺能有效降低TGF-β1、MDA的表達和提高血清SOD濃度，促進機體氧化-抗氧化平衡，改善百草枯中毒引起的肺過氧化損傷。