草烏甲素通過調節(jié)TRPV1受體功能減輕神經病理性疼痛大鼠疼痛的機制

魏建忠， 王 云， 寇士順

(1.北京時珍堂中西醫(yī)結合醫(yī)院麻醉科， 北京 100071 2.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院麻醉科， 北京 100020 3.北京中醫(yī)醫(yī)院麻醉科， 北京 100010)

神經性疼痛可能由外周或中樞神經系統(tǒng)的損傷，炎癥或疾病引起，其特征在于自發(fā)性疼痛(即持續(xù)性，陣發(fā)性)和痛覺過敏或異常性疼痛形式誘發(fā)性致敏[1,2]。瞬時受體電位香草酸亞型1(The transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)，是一種非選擇性陽離子通道，由辣椒素，樹脂毒素等外源物激活[3,4]；內源性而言，TRPV1通過高溫、酸性pH、N-花生四烯酰乙醇胺、ATP，脂氧合酶產物和單?；视痛蜷_。TRPV1作為外周和中樞神經系統(tǒng)中化學和有害熱刺激的分子整合劑，能確定機體對傷害的反應[5,6]。TRPV1可用作選擇性興奮性阻斷劑的載體，特異性阻斷疼痛神經纖維傳導也通過選擇性抑制TRPV1的表達來實現(xiàn)，例如非滲透性鈉通道阻滯劑N-(2,6-二甲基苯基氨基甲?；谆?[7,8]。草烏甲素是二萜類生物堿，自發(fā)現(xiàn)以來一直用于治療慢性疼痛，如癌癥晚期疼痛、良性關節(jié)痛、腰及四肢關節(jié)扭傷、挫傷、腰肌勞損及腰背痛等[9]。本研究擬探討草烏甲素通過調節(jié)TRPV1受體功能減輕神經病理性疼痛大鼠疼痛的機制，為神經病理性疼痛的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要藥物、試劑與儀器:草烏甲素(原料藥，純度99%，重慶賽普那斯科技有限公司，批號10769-003)；地塞米松(原料藥，純度98%，武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司，批號LM190317)；QuickPrepMicro mRNA純化試劑盒、SYBR Green RT-PCR試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號65415、63127)；抗生物素蛋白-生物素復合物試劑盒(上海玉博生物科技有限公司，批號180613)；磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、大鼠抗TRPV1一抗、Tween-20(PBST)試劑(美國sigma公司，批號SA1135、SA2017、SA3249)；CAS試劑盒(上海斯信生物科技有限公司，批號20180519)；生物素化的二抗山羊抗大鼠(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號ab33247)；Fas、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-6(Caspase-6) ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司，批號：QA698126、MJ471369、OI479512)；Electric Von Frey型電子測痛儀(天津儀數(shù)科技有限公司)；7370型足底測試儀(北京拜安吉科技有限公司)；QuantStudio5型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；CM3050S型冷凍切片機(德國Leica公司)。

1.2動物飼養(yǎng)及分組:成年SPF級別SD大鼠由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供，6～8周齡，體重212.36～24.63g，動物生產許可證號：SCXK(云)2018-0017，動物使用許可證號：SYXK(云)2018-0016，動物質量合格證號：20180347，在無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)環(huán)境中單籠喂養(yǎng)，溫度受控為(24±1)℃，濕度受控為(50%～60%)，光/暗循環(huán)為12：12h。所有動物實驗程序均經本院動物倫理委員會批準，并按照美國國立衛(wèi)生研究院關于動物護理的指導原則和有意識動物實驗性疼痛調查的倫理指南進行。所有大鼠在進入試驗前1周隨機分成3組：對照組、模型組、地塞米松、草烏甲素低、高劑量組、每組20只，雌雄各半，動物自由攝取飼料、自由飲水。

1.3各實驗組的制備:各組大鼠禁食、禁水12h，進行L5-脊神經結扎。模型組、地塞米松組、草烏甲素低、高劑量組在氟烷(2%)麻醉下，脊柱左側附近L5脊神經與粘附的組織分離，用四個6-0絲線松散結扎，結扎間距離約1mm，術后縫合肌肉皮膚層。隨后按照Decosterd和Woolf描述的程序進行神經損傷程序[10]，在麻醉下，分離股二頭肌，暴露左側坐骨神經及其3個末端分支，將普通腓骨和脛神經用6-0絲線縫合，并在結扎的遠端橫切，移除3～5mm的神經部分，在手術過程中保持腓腸神經完整，避免與神經接觸，注意預防感染并盡量減少炎癥的影響。對照組大鼠的L5脊神經同樣暴露但未結扎，并縫合皮膚層和肌肉。草烏甲素組大鼠于造模成功第1天開始給予相應藥物鞘內注射(注射體積：1.0mL/100g)，具體操作流程為：在麻醉下，在L5和L6椎骨之間插入26G規(guī)格的針頭，注入不同劑量草烏甲素(40、80mg/kg；預實驗求出草烏甲素LC50為160mg/kg，以1/2 LC50為高劑量，2倍間距為低劑量)，每天1次，持續(xù)給予3周，地塞米松組注入地塞米松(40mg/kg；預實驗求出地塞米松LC50為80mg/kg，以1/2 LC50為有效劑量組)，對照組和模型組鞘內注射給予等體積生理鹽水。

1.4機械痛閾值、熱痛閾、疼痛加權評分的測定:Electric Von Frey電子測痛儀觸壓大鼠左足第3、4趾間的皮膚，測定機械痛閾值。使用7370足底測試儀測試熱痛，將玻璃地板下面的輻射熱源瞄準在后爪足足跟底表面上的的脂肪部分，在實驗開始時調節(jié)光的強度，使得平均基線潛伏期為約22s并且施加25s的截止?jié)摲?。在每個測試階段中對每個后爪進行四次潛伏期測量，在連續(xù)測試之間至少間隔5min交替測試每只后爪，將每側潛伏期的4次測量平均值作為每次測試的結果。PIS評分=(TⅡ+2×TⅢ+3×TⅣ)÷300，其中TⅡ、TⅢ、TⅣ分別為5min內出現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級的時間(s)。足掌輕微接觸玻璃缸面，活動時有跛行為Ⅱ級；足抬起，不接觸玻璃缸面為Ⅲ級；大鼠舔咬注射足或抽動為Ⅳ級。

1.5TRPV1 mRNA在脊髓組織中表達的測定:根據(jù)制造商的說明書使用QuickPrepMicro mRNA純化試劑盒通過單步驟異硫氰酸胍方法分離總RNA，使用逆轉錄系統(tǒng)反轉錄成cDNA。通過使用SYBR Green RT-PCR試劑盒進行TRAP1基因表達的PCR分析，TRPV1的引物序列是(F)：5'-GACGCACCGCTCAACAT-3'和(R)：5'-CACATCAAACATGGACGGTTT-3'。GAPDH用作內部對照，其引物序列為(F)：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'和(R)：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。所有引物均由深圳華大基因股份有限公司純化和合成。實時PCR循環(huán)條件是95℃持續(xù)30s的一個循環(huán)，接著是95℃持續(xù)5s和60℃持續(xù)34s的40個循環(huán)。2-△△Ct法計算TRPV1 mRNA水平。

1.6TRPV1 蛋白在脊髓組織中表達的測定:實驗結束后進行椎板切除術解剖脊髓的L5-6區(qū)段，并在4%多聚甲醛中固定6h，之后將它們在4℃下浸入30%蔗糖中48h。在冷凍切片機上將冷凍組織切成3mm的厚度。使用抗生物素蛋白-生物素復合物方法處理組織切片用于免疫染色。具體操作步驟為：將切片用0.05M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，并在3%過氧化氫中溫育10min。漂洗后，將切片用CAS塊在室溫下封閉10min，然后在4℃下在PBS中與大鼠抗TRPV1一抗(1：500)孵育過夜。用含有Tween-20(PBST)的PBS依次沖洗切片，然后在室溫下與生物素化的二抗山羊抗大鼠(1：1000)一起溫育2h，并用于定量TRPV1蛋白表達。

1.7大鼠脊髓Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平的測定:快速收獲L5脊髓背角的背側象限并在PBS中勻漿，然后在4℃下以13000×g離心15min，收集上清液用于測量Fas、Caspase-3、Caspase-6的濃度，使用相應的ELISA試劑盒。

2 結 果

2.1各組大鼠機械痛閾值、熱痛閾、PIS評分的比較:與對照組比較，模型組機械痛閾值、熱痛閾降低，PIS評分升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組機械痛閾值、熱痛閾升高，PIS評分降低(P<0.05)，且草烏甲素高劑量組機械痛閾值、熱痛閾高于草烏甲素低劑量組(P<0.05)，PIS評分低于草烏甲素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，草烏甲素低、高劑量組機械痛閾值、熱痛閾降低，PIS評分升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠機械痛閾值熱痛閾PIS評分的比較

2.2各組大鼠脊髓組織HE染色比較:對照組脊髓區(qū)神經元細胞結構正常，染色清晰；模型組脊髓區(qū)可見大量壞死神經元，可見炎癥細胞浸潤；地塞米松組及草烏甲素高劑量組炎癥細胞浸潤減少，神經元細胞壞死程度減輕；草烏甲素低劑量組仍可見明顯脊髓破壞，見圖1。

圖1 各組大鼠右側脊髓組織HE染色比較(400×)

2.3各組大鼠脊髓TRPV1 mRNA表達水平比較:與對照組比較，模型組TRPV1 mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組TRPV1 mRNA水平降低(P<0.05)，且草烏甲素高劑量組TRPV1 mRNA水平低于草烏甲素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，草烏甲素低、高劑量組TRPV1 mRNA水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠脊髓TRPV1 mRNA表達水平比較

圖2 草烏甲素對各組大鼠脊髓部TRPV1表達的影響(400×)

表3 各組大鼠脊髓TRPV1蛋白表達水平比較

2.4各組大鼠脊髓TRPV1 蛋白表達水平比較:免疫組化法下，TRPV1 主要定位于胞核，其陽性表達為棕褐色，見圖2。與對照組比較，模型組TRPV1蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組TRPV1 蛋白水平降低(P<0.05)，且草烏甲素高劑量組TRPV1 蛋白水平低于草烏甲素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，草烏甲素低、高劑量組TRPV1 蛋白水平升高(P<0.05)，見表3。

2.5各組大鼠脊髓Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平比較:與對照組比較，模型組Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白水平降低(P<0.05)，且草烏甲素高劑量組Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白水平低于草烏甲素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，草烏甲素低、高劑量組Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白水平升高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠脊髓Fas Caspase-3 Caspase-6蛋白表達水平比較

3 討 論

草烏甲素已應用于諸多神經病變疼痛中，如三叉神經痛，疼痛性糖尿病神經病變，復雜區(qū)域疼痛綜合征(CRPS)和帶狀皰疹后神經痛。草烏甲素對神經系統(tǒng)和神經性疼痛的作用正在被認識到[11]。研究表明，草烏甲素對含乙酰膽堿的神經末梢具有選擇性，通過切割突觸體相關蛋白SNAP-25抑制突觸前囊泡中的乙酰膽堿釋放，體內和體外實驗的新證據(jù)表明草烏甲素對神經調節(jié)劑和發(fā)射體的釋放具有許多額外的抑制作用，這對神經傳遞感覺通路至關重要。在背根神經節(jié)(DRG)的神經元中，草烏甲素抑制蛋白激酶C(PKC)介導的可溶性N乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)依賴性胞外分泌瞬時TRPV1至質膜。人體研究進一步證明草烏甲素可減少由辣椒素(一種TRPV1受體激動劑)誘導的疼痛和神經源性炎癥[12,13]。本次試驗結果表明，與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組機械痛閾值、熱痛閾升高，PIS評分降低，且草烏甲素高劑量組機械痛閾值、熱痛閾高于草烏甲素低劑量組，PIS評分低于草烏甲素低劑量組；這與上述討論符合，同時也說明草烏甲素能明顯減輕神經病理性疼痛大鼠疼痛。結合各組大鼠脊髓組織HE染色，結果顯示，對照組脊髓區(qū)神經元細胞結構正常，染色清晰；模型組脊髓區(qū)可見大量壞死神經元，可見炎癥細胞浸潤；地塞米松組及草烏甲素高劑量組炎癥細胞浸潤減少，神經元細胞壞死程度減輕。這說明草烏甲素能減輕神經元細胞損傷壞死。

本研究同時探討了草烏甲素對脊髓神經元凋亡作用的影響，其結果顯示草烏甲素能明顯抑制脊髓神經元凋亡。研究已證實TRPV1通道在傷害性和神經性疼痛中的核心作用。TRPV1在小直徑感覺傳入C纖維和Ad纖維中表達，這些神經纖維包含各種神經肽，如P物質和/或降鈣素基因相關肽；TRPV1也存在于中樞神經系統(tǒng)(CNS)和非神經元組織中[14]。在神經損傷引起的熱痛覺過敏和糖尿病神經病變期間，均發(fā)現(xiàn)TRPV1的表達水平明顯升高。本次研究結果表明，地塞米松組、草烏甲素各劑量組TRPV1 mRNA和蛋白水平低于模型組，且草烏甲素高劑量組TRPV1 mRNA和蛋白水平低于草烏甲素低劑量組；這與上述討論符合，同時也提示草烏甲素能抑制TRPV1的表達。草烏甲素抑制TRPV1受體/通道表達的機制尚不完全清楚，但可能與其阻斷神經元胞吐作用的能力有關。據(jù)報道[15]，TRPV1通道向神經元表面的活性依賴性遞送可能有助于外周傷害感受器終端中熱性痛覺過敏的累積和維持。草烏甲素可阻斷由佛波酯或代謝型谷氨酸受體mGluR5激活的PKC誘導的TRPV1膜易位，因為TRPV1的軸突表達取決于與SNARE復合物的蛋白質的相互作用，草烏甲素可導致SNAP-25復合物的去穩(wěn)定化因此抑制TRPV1對細胞表面的SNARE依賴性胞吐作用，降低周圍神經軸突中的TRPV1表達。本研究同時探討了草烏甲素對大鼠脊髓凋亡蛋白Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白的影響，結果顯示，草烏甲素可抑制大鼠脊髓凋亡蛋白Fas、Caspase-3、Caspase-6表達，提示草烏甲素抑制脊髓神經元凋亡。

綜上所述，草烏甲素能減輕大鼠神經病理性疼痛，其機制與草烏甲素抑制TRPV1受體功能進而抑制脊髓神經元凋亡有關。