硫堇修飾多壁碳納米管電極電化學測定人血清中的蛋白質(zhì)

董丹秀，潘若辰，張偉祿,?，楊麗珠

(1．溫州大學化學與材料工程學院，浙江溫州 325035；2．溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江溫州 325035)

蛋白質(zhì)是一類生物有機大分子，是生命的物質(zhì)基礎，也是構(gòu)成細胞的基本的物質(zhì)．蛋白質(zhì)在完成有機體內(nèi)的生化代謝和有機體多樣的生理功能中發(fā)揮著非常重要的作用．因此，蛋白質(zhì)的定量分析在臨床醫(yī)學和生命科學的研究中是非常重要的．目前，定量測定蛋白質(zhì)的方法主要有比色分析法[1-2]、熒光分析法[3-4]和共振光散射法[5]等．也有文獻報道利用蛋白質(zhì)與有機染料小分子、藥物小分子等相互作用來測定蛋白質(zhì)的濃度，但多采用光譜分析法[6-7]．電分析化學法具有操作簡便、高靈敏度和高選擇性等優(yōu)點，同時不會受到顏色的干擾，近年來在生命科學領域中有著廣泛的應用．硫堇（Thionine, TH）是一種結(jié)構(gòu)對稱，具有芳環(huán)π-π共軛體系，帶有正電荷的吩噻嗪類陽離子染料，因其具有紫外吸收和電化學活性，故可使用光譜及電化學方法進行研究[8-10]．1991年，碳納米管由日本科學家飯島博士（Iijima S.）首次發(fā)現(xiàn)[11]．它是一種針狀的管形的碳單質(zhì)，具有穩(wěn)定晶體結(jié)構(gòu)，同時具有導電性好、比表面積大及較高催化活性等優(yōu)點，近年來在電化學傳感器方面受到頗多關(guān)注[12-15]．

本文利用硫堇通過π-π共軛作用修飾到多壁碳納米管電極上，制備成硫堇/多壁碳納米管修飾電極作為工作電極，利用硫堇與蛋白質(zhì)之間的相互作用構(gòu)建了一種簡便的電化學定量檢測蛋白質(zhì)的方法．該方法簡單、有效，具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可用于檢測人血清樣品中蛋白質(zhì)含量．

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀 器

電化學實驗在電化學系統(tǒng)（上海辰華儀器有限公司, CHI660a）上進行．三電極體系：多壁碳納米管（Multiwall Carbon Nanotubes, MWNTs）修飾玻碳電極（GCE）為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極．紫外-可見光譜圖在紫外-可見分光光度儀（Varian Cary 50）上測定．pH值在pH計（上海科學精密儀器有限公司, PHS-3C）中測定．

1.1.2 試 劑

牛血清白蛋白購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，溶菌酶（Lyso）購自上海伯奧生物科技有限公司，人血清白蛋白（HSA）和硫堇購自Sigma-Aldrich公司，上述樣品配制成一定濃度的儲備液，置于4℃的冰箱．羧基化的多壁碳納米管（直徑在40 - 60 nm之間，純度 > 95%）購自深圳納米港高科技有限公司．二甲基甲酰胺（DMF）購自上海第四試劑廠．緩沖溶液的配制：磷酸鹽緩沖溶液（PBS）由一定量的0.2 mol/L NaH2PO4溶液和0.2 mol/L Na2HPO4溶液混合；NaAc-HAc緩沖溶液由一定量的0.2 mol/L NaAc溶液和0.2 mol/L HAc溶液混合；Britton-Robinson（B-R）緩沖液由0.04 mol/L H3PO4、0.04 mol/L HAc和 0.04 mol/L H3BO3溶液混合，再用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值．其它試劑均為分析純．實驗用水為超純水，實驗在室溫下進行．

1.2 實驗方法

1.2.1 多壁碳納米管修飾電極（MWNTs/GCE）的制備

在高溫條件下，將多壁碳納米管在2.0 mol/L的硝酸中攪拌回流純化7 h，然后在濃鹽酸中超聲分散1 h，之后用超純水沖洗至中性[16]，放入60℃的烘箱干燥12 h后備用．將2.0 mg的多壁碳納米管加入到1.0 mL的DMF中，超聲3 h分散得到黑色多壁碳納米管-DMF分散液．玻碳電極在0.3 μm和0.05 μm氧化鋁粉末中拋光，再分別用丙酮、乙醇和超純水超聲清洗，置于空氣中干燥、冷卻，然后在電極表面滴涂10 μL的多壁碳納米管-DMF分散液，紅外燈烘干后制得多壁碳納米管修飾電極（MWNTs/GCE）．

1.2.2 硫堇修飾的多壁碳納米管電極（TH/MWNTs/GCE）的制備

將上述制得的MWNTs/GCE浸入到2 mg/mL硫堇溶液中反應20 min，再取出用超純水清洗30 min，以除去硫堇在電極表面的物理吸附，室溫下晾干后制得硫堇修飾碳納米管電極（TH/MWNTs/GCE），將修飾電極浸泡在B-R的緩沖液中（pH = 5.0）待用．

1.2.3 電化學測定方法

TH/MWNTs/GCE在B-R緩沖溶液（pH = 5.0）中用連續(xù)循環(huán)伏安掃描法在-0.8 - 0.4 V（vs.Ag/AgCl）范圍內(nèi)掃描，形成穩(wěn)定的峰電流．磁力攪拌下加入一定量的BSA并反應5 min，然后用循環(huán)伏安法（Cyclic Voltammetry, CV）或線性掃描伏安法（Linear Sweep Voltammetry, LSV）測定硫堇的氧化還原峰峰電流的變化．

1.2.4 交流阻抗法（EIS）

在10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的溶液（含0.1mmol/L KCl）中記錄交流阻抗譜圖．正常電位下，頻率：10 Hz - 100 kHz，電壓振幅：1 mV．

1.2.5 紫外-可見分光光度法

配制5組待測溶液：0.4 mg/mL BSA，0.06 mg/mL硫堇，0.06 mg/mL硫堇 + 0.4 mg/mL BSA混合液、0.06 mg/mL硫堇 + 0.8 mg/mL BSA混合液和0.06 mg/mL硫堇 + 1.2 mg/mL BSA．記錄200 - 800 nm波長范圍內(nèi)的紫外-可見分光光譜圖．

2 結(jié)果和討論

2.1 BSA在TH/MWNTs/GCE上的電化學行為

圖1是當掃描速度為0.1 V·s-1時、不同類型的電極在B-R緩沖液（pH = 5.0）中的循環(huán)伏安（CV）曲線．圖1中曲線a為裸玻碳電極（GCE）的CV曲線．曲線b為多壁碳納米管修飾玻碳電極的CV曲線，可以看出背景信號明顯增大，這是由于多壁碳納米管修飾后電極的導電能力增大的結(jié)果．當多壁碳納米管修飾玻碳電極在2.0 mg/mL濃度的硫堇溶液中反應20 min，得到了硫堇修飾的多壁碳納米管電極（曲線c），可以在-0.08 V和-0.15V觀察到一對很明顯的硫堇的氧化還原峰，這是因為硫堇分子中的芳香環(huán)可以通過π-π共軛作用吸附到多壁碳納米管上．當溶液中加入0.04 mg/mL BSA后，硫堇的氧化還原峰峰電流明顯下降，而峰電位基本保持不變（曲線d），當加入更多量0.08 mg/mL的BSA時，硫堇的氧化還原峰峰電流下降更加明顯，這可能是由于BSA和硫堇之間形成了非電活性的化合物的緣故．

2.2 掃描速度的影響

通過循環(huán)伏安法對TH/MWNTs/GCE在掃描速度分別為0.025 V·s-1、0.05 V·s-1、0.075 V·s-1、0.1 V·s-1、0.12 V·s-1、0.15 V·s-1、0.2 V·s-1時進行掃描，觀察其氧化還原峰電流，如圖2（a）．實驗發(fā)現(xiàn)，硫堇的氧化還原峰的峰電流都隨著掃速的增加而相應增大，且氧化還原峰的峰電流均與掃速呈線性關(guān)系，線性方程分別為ipa(μA) = 13.334 + 508.359V(V·s-1)（R= 0.995）和ipc(μA) =-12.340-502.151V(V·s-1)（R= 0.996），其中R為線性系數(shù)．說明，TH/MWNTs/GCE電極表面的氧化和還原反應是都是受吸附控制的．

上述溶液加入0.08 mg/mL的BSA得到的BSA/TH/MWNTs/GCE電極在0.025 - 0.2 V·s-1的掃速范圍內(nèi)掃描，檢測硫堇的氧化還原峰的峰電流變化，如圖2（b）．實驗發(fā)現(xiàn)，在同等的掃速條件下，氧化還原峰的峰電流均減小，并且氧化還原峰的峰電流與掃速之間呈線性關(guān)系，線性方程為ipa(μA) = 4.058 + 269.588V(V·s-1)（R= 0.997）和ipc(μA) = -3.261-201.440V(V·s-1)（R= 0.999）．說明BSA/TH/MWNTs/GCE電極表面的氧化和還原反應均是是受表面吸附控制的．實驗結(jié)果說明，在體系中加入BSA后，游離的硫堇濃度的降低，導致氧化還原峰電流的降低，進一步說明有非電活性物質(zhì)產(chǎn)生[17]．

圖2 TH/MWNTs/GCE在不同掃速條件下加入BSA前后的循環(huán)伏安曲線

2.3 紫外-可見光譜圖

通過紫外-可見光譜實驗，進一步證明了BSA和硫堇之間的結(jié)合作用，如圖3所示．BSA在278 nm處有一吸收峰，硫堇有三個吸收峰，分別在：235 nm，282 nm和600 nm．當在硫堇溶液中加入了0.4 mg/mL BSA后，235 nm處的吸收峰消失，282 nm的吸收峰增強，且稍有藍移，600 nm處的吸收峰下降．當繼續(xù)加入一定量的BSA（曲線d和e）后，282 nm的吸收峰增強，且稍有藍移，600 nm處的吸收峰繼續(xù)呈下降趨勢，說明硫堇和BSA發(fā)生結(jié)合．

圖3 硫堇和BSA作用的紫外分光光度圖

2.4 電化學交流阻抗圖（EIS）

根據(jù)電化學交流阻抗的變化來判斷電極表面的狀況．我們在電化學工作站上測定不同的電極修飾所得到的電極Nyquist圖譜（通過阻抗值的虛部Zim對其實部Zre作圖），轉(zhuǎn)移阻抗值（Ret）的數(shù)值等同于半圓的直徑，對應的Nyquist圖譜是通過高頻區(qū)域的半圓連接到低頻區(qū)域的直線．根據(jù)文獻[18]可知，半圓反映電子轉(zhuǎn)移過程的特征，45度直線反映擴散控制特征．實驗結(jié)果如圖4所示．裸玻碳對應曲線（曲線a）在高頻區(qū)域有較小直徑的圓弧（約為30 Ω），這說明裸玻碳電極（GCE）表面的反應是受擴散控制的，裸玻碳電極阻擋Fe(CN)63-/4-的氧化還原反應過程的電子傳輸較?。鳛閷Ρ?，MWNTs/GCE電極對應的曲線（曲線b）在高頻區(qū)域的圓弧直徑接近于零，說明了碳納米修飾電極能夠非常有效促進電子的轉(zhuǎn)移．將碳納米管修飾電極浸入一定濃度的硫堇溶液反應后，硫堇可以通過π-π共軛作用鍵合到修飾電極（MWNTs/GCE）表面，從而抑制了電子間的轉(zhuǎn)移（曲線c，高頻區(qū)域圓弧直徑為160 Ω）．在溶液中再加入0.08 mg/mL BSA后（曲線d），BSA/TH/MWNTs/GCE高頻區(qū)域圓弧直徑為240 Ω，由此可見電子轉(zhuǎn)移抑制明顯，表面BSA與硫堇相互作用后生成一種非電活性物質(zhì)，與之前實驗得到的結(jié)果一致．

圖4 不同電極的交流阻抗圖圖譜

2.5 實驗參數(shù)的優(yōu)化

2.5.1 支持電解質(zhì)的選擇

我們對支持電解質(zhì)-緩沖溶液進行了選擇．試驗不同的緩沖溶液對硫堇的氧化還原峰的影響，包括0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH：4.5 - 7.0）；0.2 mol/L的NaAc-HAc緩沖溶液（pH：3.8 -5.4）和B-R緩沖溶液（pH：2.5 - 7.5）．實驗發(fā)現(xiàn)在B-R緩沖溶液中峰電流最大、峰形最好且可逆性最好，因此選擇B-R緩沖溶液作為支持電解質(zhì)．同時也試驗了不同的pH值的B-R緩沖溶液對硫堇氧化還原峰的影響（圖5）．發(fā)現(xiàn)隨著酸性的增大，峰電位向正電位方向移動，說明有H+參與反應的進行．當pH為5的時候，硫堇的氧化還原峰的峰形好且峰電流較大，選擇支持電解質(zhì)為pH為5的B-R緩沖溶液．

2.5.2 修飾劑用量的選擇

實驗選擇不同量的碳納米管-DMF修飾劑（2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL）分別和2.0 mg/mL的硫堇溶液發(fā)生反應，觀察其氧化還原峰電流的變化（圖6）．實驗發(fā)現(xiàn)，當修飾劑的用量達到10 μL時，氧化還原峰已經(jīng)比較明顯且峰形較好，最終選擇修飾劑的用量為10 μL．

圖5 B-R緩沖溶液的pH值對BSA測定的影響

圖6 碳納米管-DMF修飾劑用量的影響

2.5.3 硫堇和碳納米管修飾電極間的反應時間的選擇

實驗考察了多壁碳納米管修飾電極（MWNTs/GCE）和硫堇溶液（2.0 mg/mL）不同的反應時間（分別為5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min），比較硫堇的氧化還原峰的峰電流大?。▓D7）．實驗發(fā)現(xiàn)，在5 - 20 min的范圍內(nèi)，隨著反應時間的增加，硫堇的峰電流隨之增大．當反應時間大于20 min，硫堇的峰電流增加不明顯，說明兩者反應已經(jīng)達到飽和．因此，選定20 min作為硫堇和多壁碳納米管修飾電極的反應時間．

圖7 硫堇和碳納米管修飾電極間的反應時間的影響

圖8 BSA和硫堇修飾碳納米管電極上硫堇的反應時間的影響

2.5.4 BSA和硫堇修飾碳納米管電極上硫堇的反應時間的選擇

將一定量的BSA（0.06 mg/mL）加到浸有硫堇修飾多壁碳納米電極的緩沖溶液里，靜置．實驗了不同的反應時間（分別為0.5 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min和8 min）的影響（圖8），實驗發(fā)現(xiàn)，當反應時間到達及超過5 min后，硫堇的氧化還原峰峰電流基本保持穩(wěn)定，因此選擇5 min作為反應的時間．

2.6 BSA的線性、測定穩(wěn)定性及重現(xiàn)性

采用LSV分別測定了硫堇修飾多壁碳納米管電極上的氧化還原峰與BSA的作用，如圖9所示．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著BSA濃度增加，硫堇氧化還原峰的峰電流相應下降，這是因為BSA濃度的增加，導致更多的非電活性物質(zhì)產(chǎn)生．硫堇的氧化還原峰的峰電流的下降值和加入的BSA濃度在0.01 - 0.12 mg/mL范圍之間呈線性關(guān)系，如圖9所示．氧化峰的線性方程為Δipa(μA) = 3.401 +336.775cBSA(mg/mL)（R= 0.997），還原峰的線性方程為Δipc(μA) = -4.252 - 415.045cBSA(mg/mL)（R= 0.997），最低檢測限達到0.004 mg/mL．

實驗對比了該體系對溶菌酶（Lyso）和人血清白蛋白（HSA）的氧化還原響應，以氧化峰為例，得到相應的工作曲線，分別為Δipa(μA) = 5.678 + 405.235cHSA(mg/mL)（HSA的濃度在0.008 -0.08 mg/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R= 0.998），Δipa(μA) = 10.578 + 289.345cLyso(mg/mL)（Lyso的濃度在0.01 - 0.20 mg/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R= 0.995）．由于本方法對不同類別的蛋白均有響應，因此可用于測定血清樣品中的總蛋白含量．目前熒光光譜法測定蛋白質(zhì)的含量[4-5,19-20]發(fā)展非常迅速，但該方法不僅耗時，還需比較昂貴的樣品和儀器設備．極譜分析測定蛋白質(zhì)[21-22]的靈敏度較高，但缺點是毒性較大．我們設計的電化學方法測定蛋白質(zhì)具有快速、經(jīng)濟、簡便等優(yōu)點，方法對于一些在短時需要結(jié)果的實驗是非常有利的．

圖9 不同濃度BSA和硫堇相互作用的線性掃描伏安曲線

對同一支TH/MWNTs/GCE電極，加入0.08 mg/mL BSA前后進行連續(xù)的10次測定，評價本實驗的重現(xiàn)性．實驗發(fā)現(xiàn)，加入BSA前后的相對標準偏差（Relative Standard Deviation, RSD）分別是2.2%和2.4%，顯示本實驗具有很好的重現(xiàn)性．另外，我們用相同方法修飾10支TH/MWNTs/GCE電極，考察不同修飾電極間的重現(xiàn)性．結(jié)果顯示，相同方法修飾的10支不同的電極（TH/MWNTs/GCE）的RSD為4.3%，說明制備TH/MWNTs/GCE的方法有實用的價值．

2.7 干擾物質(zhì)的影響

實驗了一些氨基酸（包括L-白氨酸，D/L-酪氨酸，絲氨酸，酪氨酸，L-胱氨酸）和實驗室常見的物質(zhì)（包括蘋果酸，葡萄糖、檸檬酸）和一些金屬離子（包括K+、Ca2+、Zn2+、Na+）等對測定的影響，結(jié)果見表1．

實驗表明，當相對誤差在10%以內(nèi)時，低濃度的上述物質(zhì)對測定結(jié)果的影響不大．相同濃度的D/L-酪氨酸、絲氨酸、L-胱氨酸、蘋果酸、檸檬酸、Ca2+、Zn2+、Na+、K+不影響測定，相同濃度的L-白氨酸和葡萄糖稍有影響．然而，在實際的樣品測定過程中，血清樣品常稀釋1 000倍以上，因此以上物質(zhì)在測定溶液中的濃度很小，基本可以不考慮干擾的問題．

2.8 人血清樣品中蛋白質(zhì)的分析

移取0.1 mL人血清樣品（4個不同的血清樣品，由溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院的檢驗科提供），用超純水配置成100 mL溶液，置于容量瓶中，置于4℃冰箱中備用．按照擬定方法測定1.0 mL的樣品，并做回收率實驗．回收率在97.9% - 103.2%之間，5次測定的RSD在2.0% - 3.0%之間，結(jié)果見表2．與經(jīng)典的考馬斯亮藍法（CBB G2250）[23]結(jié)果一致．

表1 干擾物質(zhì)的測定結(jié)果（n = 3）

表2 樣品的分析結(jié)果和回收率實驗結(jié)果（n = 5）

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了一種基于硫堇修飾多壁碳納米管電極上硫堇與蛋白質(zhì)的相互作用的電化學檢測蛋白質(zhì)的方法．運用電化學方法（循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法）和紫外-可見光譜法來研究硫堇修飾的碳納米管電極上硫堇與BSA的相互作用，實驗表明BSA可以和硫堇修飾碳納米管電極上的硫堇之間生成了一種非電活性化合物．在實驗選定的最佳測量條件下，硫堇的氧化還原峰峰電流的下降值和BSA濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系．方法簡單、有效，具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可用于檢測人血清樣品中蛋白質(zhì)含量．