鼠李糖桿菌GG對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究

陸婷，倪 銘，夏秀秀，劉立明，趙翠青2,，金寧一

(1．溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035；2．溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所，浙江溫州 325035；3．溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州 325035；4．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林吉林 132101)

酒精性肝病（ALD）是指由于長期大量飲酒所導(dǎo)致的一系列肝臟疾病，是僅次于病毒性肝炎的第二大類肝?。凭诟闻K中代謝可引起氧化應(yīng)激，影響肝臟脂質(zhì)代謝誘使脂質(zhì)堆積，脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步引起肝細(xì)胞的炎癥、壞死、纖維化以及硬化，表現(xiàn)為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化并最終可發(fā)展為肝癌[1]．益生菌是一類對(duì)宿主健康有益的活性微生物，早在1907年就有研究提出攝入活性微生物對(duì)人體有益的觀點(diǎn)[2]．LGG（鼠李糖桿菌GG株，Lactobacillus Shamnosus GG Strain，簡寫為Lactobacillus GG或LGG），是目前應(yīng)用最多的益生菌之一，我們的前期研究表明，LGG及其培養(yǎng)上清對(duì)酒精引起的肝損傷均有保護(hù)作用[3-4]．本研究使用LGG對(duì)小鼠連續(xù)預(yù)處理4周時(shí)間，建立小鼠急性肝損傷模型，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了LGG對(duì)急性酒精性肝損傷保護(hù)的作用機(jī)制，即LGG對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用是通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝實(shí)現(xiàn)的．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選購6 – 8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重18 – 22 g，購自南京君科生物工程有限公司．飼養(yǎng)期間自由采食．所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，許可證編號(hào)為SYXK（浙）2015-0009．

1.1.2 菌 株

鼠李糖乳桿菌GG（LGG），購于美國ATCC菌種保藏中心．

1.1.3 試 劑

MRS瓊脂及肉湯培養(yǎng)基（海博生物），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所），甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒（Abcam），UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶牌），SYBR-Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液（Applied Biosystems），蘇木素伊紅染色試劑盒（碧云天），中性樹膠（索萊寶），脫脂牛奶（BD），30%丙烯酰胺（索萊寶），Trisbase（索萊寶），BCA蛋白的測(cè)定試劑盒（碧云天），RIPA裂解液（索萊寶），蛋白Marker（全式金），ECL超敏發(fā)光液（索萊寶），Loading Buffer（全式金）．

1.1.4 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)（Thermo Fisher Scientific），高壓滅菌鍋（Shenan），分析天平（Mettler Toledo），電子天平（Shimadzu），高通量組織研磨儀（新芝），離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific），PCR儀（Thermo Fisher Scientific），生化培養(yǎng)器（新苗），倒置顯微鏡（Olympus），紫外分光光度計(jì)（Synergy Biotek），石蠟切片機(jī)（Leica），電熱恒溫鼓干燥箱（Blue Pard），電泳裝置（Bio-Rad），轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad），凝膠成像儀（Bio-Rad）．

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

凍存菌株復(fù)蘇、傳代三次后，接入MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，4℃下6 000 r / min離心20 min，棄去上清，收集菌體．

1.2.2 動(dòng)物模型的建立

選取6 – 8周齡SPF級(jí)健康C57BL/6雄性小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（Pair-Fed，PF）、酒精組（Alcohol Fed，AF）、酒精 + LGG組（AF + LGG），每組10只．實(shí)驗(yàn)期間小鼠正常飼喂．AF + LGG組小鼠每天給予LGG處理（灌胃1 × 109CFU / 只），PF組和AF組小鼠每天給予MRS培養(yǎng)基處理，連續(xù)4周．實(shí)驗(yàn)期間每周記錄小鼠體重．各組小鼠禁食16 h后，實(shí)驗(yàn)最后一天清晨，AF組和AF + LGG組小鼠采用50%（V/V）的酒精按6 g / Kg的劑量灌胃，建立小鼠急性肝損傷模型，PF組給予等熱量的麥芽糖糊精．酒精或麥芽糖糊精處理6小時(shí)后處死小鼠，收集小鼠血清、肝臟組織以備后期實(shí)驗(yàn)使用．采血后迅速剖取肝臟，用冷生理鹽水洗凈，濾紙吸濕后稱取肝臟濕重，計(jì)算肝系數(shù)．肝系數(shù) =（肝臟質(zhì)量 / 體總質(zhì)量）×100%．

1.2.3 血液生化分析

小鼠外周血置4℃離心機(jī)中，3 000 r / min離心15 min，收集上層血清．分別參照試劑盒操作說明書，檢測(cè)各組小鼠外周血血清中ALT和ALT的含量．

1.2.4 肝臟甘油三脂檢測(cè)

稱取適量肝臟組織，置于NP40 / ddH2O混合液中，使用組織勻漿機(jī)研磨組織后，參照試劑盒操作說明書測(cè)定肝臟組織中甘油三脂的含量．

1.2.5 肝臟組織病理組織學(xué)分析

新鮮肝臟組織用福爾馬林溶液固定，經(jīng)脫水透明、浸蠟包埋、切片后，對(duì)肝臟組織切片進(jìn)行脫蠟、脫苯、復(fù)水和H&E染色．在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)變化．

1.2.6 總RNA的提取及qRT-PCR的檢測(cè)

參照試劑盒操作說明書，采用Trizol法提取肝臟組織的總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后對(duì)肝臟組織中脂質(zhì)合成和分解相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行RT-PCR分析．

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

參照RIPA組織裂解液操作說明書，提取肝臟組織總蛋白后，參照BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度．取30 μg蛋白樣品進(jìn)行白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）分析，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影成像，使用Image Lab 4.1 programs軟件進(jìn)行特異性條帶定量分析．

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)均采用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean ± SEM）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 7.00軟件分析，兩組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)．*P< 0.05、**P< 0.01、***P< 0.001分別表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異和統(tǒng)計(jì)學(xué)有極其顯著的差異．

2 結(jié) 果

2.1 LGG預(yù)處理緩解酒精引起的肝臟損傷

研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，酒精組小鼠肝系數(shù)有所升高；與酒精組相比，酒精 + LGG組小鼠肝系數(shù)有所降低，但是均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）．外周血中丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的含量是評(píng)估肝臟損傷的重要指標(biāo)，本研究為了探究LGG對(duì)小鼠急性酒精肝損傷的影響，對(duì)小鼠外周血中ALT和AST的含量進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1B、圖1C所示．

從圖1中可以看出，與對(duì)照組相比，酒精組小鼠外周血中ALT、AST的含量顯著升高，LGG預(yù)處理可顯著降低酒精引起的小鼠外周血中ALT的升高，這說明LGG預(yù)處理可以顯著緩解酒精引起的肝臟損傷．

2.2 LGG預(yù)處理緩解酒精引起的肝臟脂質(zhì)堆積

組織學(xué)研究顯示，飲酒會(huì)引起肝臟脂質(zhì)的堆積．為了探究LGG預(yù)處理對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)堆積的影響，我們通過觀察急性酒精肝臟損傷模型中小鼠的肝臟組織病理切片，發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴浸潤，但是用LGG預(yù)處理后再給予小鼠急性酒精處理，小鼠的肝細(xì)胞內(nèi)脂滴浸潤大幅度減少，幾乎恢復(fù)至對(duì)照組狀態(tài)（圖2A）．甘油三酯（TG）是人體內(nèi)含量最多的脂質(zhì)，為了量化圖2A中觀察到的小鼠肝臟脂質(zhì)堆積情況，我們檢測(cè)了各組小鼠肝臟中TG的含量，如圖2B所示，可以看出，與對(duì)照組小鼠相比，酒精組小鼠肝臟組織中的TG含量顯著升高，LGG預(yù)處理可顯著降低酒精引起的小鼠肝臟組織中的TG含量的升高．

2.3 LGG預(yù)處理對(duì)肝臟脂肪合成的影響

FAS、SCD1和ACC1在肝臟脂質(zhì)合成中扮演著重要的角色．以上研究表明，LGG預(yù)處理能夠緩解酒精引起的肝臟脂質(zhì)堆積，為了確認(rèn)LGG預(yù)處理對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，我們對(duì)各組小鼠肝臟中FAS、SCD1和ACC1的mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)．研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，酒精組小鼠肝臟中FAS、SCD1和ACC1的mRNA水平以及FAS和SCD1的蛋白水平均顯著升高；與酒精組相比，LGG預(yù)處理后，F(xiàn)AS和SCD1的mRNA水平以及FAS和SCD1的蛋白水平均顯著降低．結(jié)果表明，LGG能夠有效緩解酒精引起的肝臟脂肪合成（圖3）．

2.4 LGG預(yù)處理對(duì)肝臟脂肪酸β-氧化的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LGG預(yù)處理對(duì)肝臟脂肪酸β-氧化的影響，我們分析了各組小鼠肝臟組織中脂肪酸β-氧化的相關(guān)基因CPT1、PGC1α和PPARα的mRNA水平和蛋白水平，如圖4所示．可以看出，與對(duì)照組相比，酒精組小鼠肝臟中CPT1和PGC1α的mRNA水平以及CPT1的蛋白水平顯著降低；與酒精組相比，用LGG預(yù)處理后，小鼠肝臟中CPT1和PGC1α的mRNA水平以及CPT1的蛋白水平顯著升高，進(jìn)一步表明，LGG能夠改善酒精引起的肝臟脂肪堆積狀況．

圖3 各組小鼠肝臟組織中FAS（A）、SCD1（B）和ACC1（C）的mRNA水平以及FAS（D）和SCD1（E）的蛋白水平

3 討 論

ALD是一種常見的肝損傷形式，近30年來，隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，酒精消費(fèi)呈現(xiàn)爆炸性增長，ALD的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[5]．由于ALD患者缺乏預(yù)防和治療意識(shí)，ALD往往會(huì)演變?yōu)椴豢赡孓D(zhuǎn)的肝臟損傷，如肝硬化，甚至肝癌[6]．益生菌具有抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群以及改善腸道屏障功能等作用[7]，近年來越來越多的研究表明，LGG可以用于預(yù)防和治療肝臟疾病[6-9]．同時(shí)，已有研究表明，LGG及其培養(yǎng)上清均能改善慢性酒精誘導(dǎo)的肝臟損傷狀況[10]，另外有研究指出，LGG培養(yǎng)上清預(yù)處理5天能夠緩解酒精引起的腸道通透性增加，改善肝臟損傷狀況[4]．本研究通過給予小鼠連續(xù)4周的LGG處理、然后酒精灌胃來模擬人們的日常生活習(xí)慣，對(duì)LGG在急性肝損傷中的保護(hù)作用進(jìn)行了研究．

臨床中通常通過檢測(cè)ALT和AST等水平的變化來進(jìn)行肝功能的評(píng)價(jià)．我們使用一次性灌胃的方法建立了小鼠急性肝損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)，酒精處理后，沒有接受LGG預(yù)處理的小鼠外周血中ALT和AST的水平顯著升高，而接受了LGG預(yù)處理的小鼠外周血中ALT的含量增加不明顯，說明LGG對(duì)急性酒精肝損傷有預(yù)防保護(hù)作用．

圖4 各組小鼠肝臟組織中CPT1（A）、PGC-1α（B）和PPARα（C）的mRNA水平以及CPT1（D）、PGC-1α（E）和PPARα（F）的蛋白水平

急性酒精性肝損傷受多種因素影響，本研究發(fā)現(xiàn)LGG預(yù)處理可顯著降低急性酒精引起的肝臟TG含量的增加．肝臟主要通過以下幾個(gè)方面維持脂質(zhì)代謝平衡：肝細(xì)胞甘油三脂的合成，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的β-氧化，肝細(xì)胞攝取有力的脂肪酸以及通過極低密度脂蛋白的形式輸出甘油三酯．通過分析肝臟脂肪合成重要基因FAS、SCD1和ACC1以及脂肪酸β-氧化關(guān)鍵基因CPT1、PGC1α和PPARα的mRNA水平和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)LGG可以抑制肝臟脂肪合成基因的表達(dá)并促進(jìn)脂肪酸β-氧化基因的表達(dá)．綜上，LGG是通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝而對(duì)酒精性肝病實(shí)現(xiàn)預(yù)防保護(hù)作用的，這為LGG在預(yù)防和治療酒精性肝臟疾病方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)．