基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討夏枯草治療甲狀腺癌的作用機(jī)制

涂星強(qiáng)，張晶晶，彭小彬*，杜國(guó)能，許禮笑子，許永輝，肖玉根

夏枯草（Prunella vulgaris）主要含有黃酮類化合物、五環(huán)三萜、有機(jī)酸類物質(zhì)、多糖和揮發(fā)油［1-5］，其提取物具有多種生物活性，包括調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境、抗氧化作用和抗炎作用［1，6，7］。PVL 還可以抑制人肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2（Bcl-2）和促血管新生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的蛋白表達(dá)水平，因此是治療胃癌的有效抗癌藥物［8］。夏枯草提取物還具有抗雌激素的特性，可作為治療雌激素依賴性腫瘤的藥物［9］。PVL多糖通過(guò)抑制堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的表達(dá)和BC 細(xì)胞的生長(zhǎng)而抑制人乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）［10］。由于夏枯草成分復(fù)雜，其主要有效成分及作用機(jī)制尚不清楚。

近年來(lái)，隨著系統(tǒng)生物學(xué)的普及，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為分析中藥復(fù)雜成分作用機(jī)制的重要手段。它是一種基于藥物、疾病、靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)分析方法，從整體揭示藥物的作用機(jī)制，具有整體、協(xié)同等特性，這些特點(diǎn)與中醫(yī)治病理論相吻合。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究夏枯草治療甲狀腺癌的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步應(yīng)用于甲狀腺疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 分析方法

1.1 夏枯草主要活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索夏枯草的化學(xué)成分，選擇口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18 的成分作為有效成分，并下載相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以MOL2格式保存。

1.2 活性成分及疾病靶點(diǎn)庫(kù)的構(gòu)建

通過(guò) TCMSP 及 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索夏枯草中所有活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，去除重復(fù)基因，得到夏枯草主要活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)庫(kù)。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）及 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）收集甲狀腺治療甲狀腺癌的靶點(diǎn)，檢索詞為“thyroid cancer”，去除重復(fù)基因，得到相應(yīng)的靶點(diǎn)庫(kù)。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了進(jìn)一步研究夏枯草作用靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)在蛋白水平的作用機(jī)制，我們采用R 語(yǔ)言獲取兩者間的交集，并利用R 包VennDiagram 進(jìn)行可視化，然后將交集基因輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），獲取蛋白間的相互作用信息，并通過(guò)R 語(yǔ)言進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析及可視化。

1.4 GO 和 KEGG pathway 分析

為進(jìn)一步研究核心靶點(diǎn)功能及夏枯草在治療甲狀腺癌中的主要作用通路，利用R 包c(diǎn)lusterProfiler 對(duì)上述取得的藥物和疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和 KEGG pathway 分析，設(shè)定閾值P＜0.05，q＜0.05，保留P 值最小的20 個(gè)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

為了分析活性化合物、候選靶標(biāo)以及甲狀腺癌之間的相互關(guān)聯(lián)，利用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。采用Nerwork Analyzer 功能進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，得到核心化合物。

1.6 分子對(duì)接

選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree 值前10 的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，用Autodock Vina 對(duì)核心靶點(diǎn)及相應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對(duì)接，從而驗(yàn)證核心靶點(diǎn)與夏枯草主要活性成分的結(jié)合強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 夏枯草主要活性成分

根據(jù)篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18），篩選得到夏枯草11 個(gè)主要活性成分，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 夏枯草主要活性成分信息

2.2 活性成分及疾病靶點(diǎn)庫(kù)的構(gòu)建

通過(guò)TCMSP 和PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到了夏枯草180 個(gè)活性成分靶點(diǎn)，并通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)將這些靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為基因名稱。通過(guò)檢索Gene-Cards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到752 個(gè)甲狀腺癌相關(guān)的作用靶點(diǎn)。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用R 語(yǔ)言獲取活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集（共91 個(gè)），并用R 包VennDiagram 進(jìn)行可視化（圖1），然后將交集靶點(diǎn)輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到靶點(diǎn)間的相互作用信息，并R 語(yǔ)言進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析及可視化。如圖2 所示，縱坐標(biāo)代表靶點(diǎn)基因名稱，橫坐標(biāo)代表連接度大小，顯示degree值前30 基因。

2.4 GO 和 KEGG pathway 分析

通過(guò)R 包c(diǎn)lusterProfiler 對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO（如圖3）和KEGG pathway（如圖4）分析。GO 功能富集分析得到GO 條目個(gè)（q＜0.05），其中生物過(guò)程（BP）條目1957個(gè)，主要包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等方面；細(xì)胞成分（CC）條目38 個(gè)，主要包括細(xì)胞膜、細(xì)胞器、核質(zhì)等方面；分子功能（MF）條目106個(gè)，細(xì)胞因子活性、受體配體結(jié)合、酶調(diào)節(jié)活性等方面。KEGG pathway 分析（q＜0.05）共獲得149 條通路，圖4 顯示前15 條為核心通路，主要有Toll 樣受體信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路，P53 信號(hào)通路等等，這些通路皆與腫瘤相關(guān)，表明夏枯草可以通過(guò)作用于不同的信號(hào)通路治療甲狀腺癌。

2.5 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)上述結(jié)果，利用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)（圖5）。如圖所示，三角形代表夏枯草有效成分，圓形代表作用靶點(diǎn)，六邊形代表藥物，菱形代表疾病。用Nerwork Analyzer分析可知，槲皮素degree 值為82，顯著高于其他有效成分，其次是木犀草素、山奈酚、谷甾醇。同時(shí)網(wǎng)絡(luò)圖顯示多個(gè)靶點(diǎn)與不同有效成分有聯(lián)系，體現(xiàn)了中藥治療“多成分-多靶點(diǎn)“的作用特點(diǎn)。

2.6 分子對(duì)接

基于PPI 網(wǎng)絡(luò)，我們選擇degree 排名前10 作為核心靶點(diǎn)于相應(yīng)化合物進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接得分越低，代表親和力越強(qiáng)。一般認(rèn)為，docking score＜-7 表明靶點(diǎn)與活性成分具有很好的結(jié)合活性，docking score＜-5 表明靶點(diǎn)與活性成分具有較好的結(jié)合活性，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，夏枯草4 個(gè)核心成分與甲狀腺癌相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合性均較好。我們對(duì)得分最低的3 組靶點(diǎn)與化合物基因進(jìn)行展示（圖6）。

表2 核心靶點(diǎn)-化合物分子對(duì)接打分結(jié)果

3 討 論

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，在中醫(yī)中它屬于癭瘤”病的范疇，主要以“軟堅(jiān)消癭”為主?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載夏枯草具有“散癭結(jié)氣”之功效。研究表明，夏枯草具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖（包括甲狀腺腫瘤）、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)免疫等作用［8-12］。但由于中藥成分復(fù)雜，其主要有效成分及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)、高通量篩選等技術(shù)，系統(tǒng)分析“中藥成分-疾病-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體上揭示中藥對(duì)機(jī)體疾病的干預(yù)和影響，與中藥治病理論相吻合。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)夏枯草治療甲狀腺癌的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及所涉及的功能通路進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明：夏枯草治療甲狀腺癌的主要有效成分的有11 個(gè)，包括谷甾醇、山奈酚、二十八烷醇、豆甾醇、飛燕草素、木樨草素、仙人掌黃素-Ⅰ、單葡萄糖苷、豆甾-7-烯醇（桑黃素、槲皮素，用Cytoscape 3.7.2對(duì)活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)分析可知，槲皮素degree 值為82，顯著高于其他有效成分，其次是木犀草素、山奈酚、谷甾醇，且研究表明槲皮素對(duì)治療髓樣和乳頭狀人甲狀腺癌有明顯療效［13］；木犀草素、山奈酚對(duì)各種人類甲狀腺癌細(xì)胞系具有有效的抗增殖活性［14］；谷甾醇也可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖抗腫瘤［15］，提示這四種成分極有可能是夏枯草發(fā)揮抗甲狀腺癌的核心藥效成分。這些有效成分作用于甲狀腺癌的91 個(gè)靶蛋白，PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，連接度前10的基因?yàn)锳KTI、VEGFA、CASP3、MYC、JUN、MAPK8、IL6、EGFR、MAPK1、EGF，研究表明，這些靶點(diǎn)都與腫瘤細(xì)胞的增殖和分化以及腫瘤進(jìn)展有關(guān)。如AKT1 調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過(guò)程［16，17］；VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）在許多腫瘤上表達(dá)，與腫瘤分期與進(jìn)展有關(guān)［18，19］；MYC 基因家族及其產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞增殖、永生化、去分化和轉(zhuǎn)化等，在多種腫瘤形成過(guò)程中處于重要地位等［20，21］。因此，它們可能是夏枯草治療甲狀腺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)鍵成分結(jié)合法強(qiáng)度均較好。進(jìn)一步驗(yàn)證了夏枯草可能通過(guò)這些核心藥效成分作用于相應(yīng)的靶點(diǎn)對(duì)甲狀腺癌的治療發(fā)揮作用。

KEGG pathway 分析表明，夏枯草治療甲狀腺癌的潛在作用機(jī)制多集中于細(xì)胞增殖、分化及抗炎免疫方面。其中Toll 樣受體信號(hào)通路可以通過(guò)不同的識(shí)別途徑活化多種免疫細(xì)胞，啟動(dòng)非特異性免疫應(yīng)答并激起適應(yīng)性免疫應(yīng)答以清除病原體，在炎癥、免疫細(xì)胞調(diào)控、存活和增殖方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用［22，23］；TNF 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞存活和分化以及免疫和炎癥反應(yīng)［24］；PI3K-Akt 信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、周期調(diào)控等病生過(guò)程［25］；p53 是主要的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路之一，可通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)中的Bcl-2 家族蛋白相互作用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡等［26］。因此，夏枯草可能通過(guò)多通路治療甲狀腺癌。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)闡明夏枯草可以通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路對(duì)甲狀腺癌的治療發(fā)揮作用。然而本研究是基于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)對(duì)夏枯草治療甲狀腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行的分析，故仍需進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。