七氟烷對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的右心室肥厚的影響

尹小清，鄒軍，王鍔

肺動(dòng)脈高壓繼發(fā)右心室肥厚患者圍術(shù)期嚴(yán)重不良事件發(fā)生率及死亡率很高，而受損的右心功能障礙加重是其主要原因之一［1，2］。七氟烷是臨床上最常見的吸入麻醉藥之一，大量研究證實(shí)了其在心腦血管手術(shù)麻醉中的優(yōu)越性，但是目前針對(duì)七氟烷與肺動(dòng)脈高壓和右心功能的研究很少。有研究顯示較高濃度七氟烷會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)性低血壓并嚴(yán)重?fù)p失右心功能［3］；另有研究者發(fā)現(xiàn)0.5%七氟烷可降低肺動(dòng)脈壓力而不影響循環(huán)血壓，可用于急性肺動(dòng)脈高壓的治療［4］。因此作者推測(cè)較低濃度七氟烷可能對(duì)肺動(dòng)脈高壓及右心功能不全有利，本實(shí)驗(yàn)擬研究0.5%、1.0%、1.5%三個(gè)濃度七氟烷對(duì)肺動(dòng)脈高壓及右心室肥厚大鼠的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

野百合堿（monocrotaline，MCT，美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)C2401），七氟烷（日本丸石制藥株式會(huì)所，批號(hào)29071），心室壓力容積導(dǎo)管（PV 導(dǎo)管，1.9F，美國(guó) Millar 公司），iNOS 蛋白試劑盒（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)ab3523），sGCβ1 蛋白試劑盒（美國(guó)Cayman 公司，批號(hào)160897）。

1.2 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建

健康雄性SPF級(jí)SD（Spague-Dawlay）大鼠30只，體重250～300 g，由中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白對(duì)照組（C 組，n=15）和野百合堿組（M 組，n=15），M 組腹腔單次注射1%野百合堿60 mg·kg-1，C 組腹腔單次注射相同容積溶劑。所有大鼠均正常飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

大鼠建模后飼養(yǎng)4 周，稱重后腹腔注射氯胺酮注射液60 mg·kg-1麻醉，仰臥位固定，于頸正中切口行氣管穿刺置管（16G 動(dòng)靜脈留置針），連接至小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣（潮氣量5 mL·kg-1，頻率 70～80 次·min-1）。于股動(dòng)脈穿刺置管監(jiān)測(cè)血壓、隱靜脈穿刺置管用于術(shù)中輸液。單次給予舒芬太尼1 μg·kg-1及維庫溴銨1 mg·kg-1后以舒芬太尼1 μg·kg-1·h-1和維庫溴銨3 mg·kg-1·h-1的持續(xù)泵注。行正中開胸，予3 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）呼氣末正壓防止肺塌陷。直視下于心尖處刺破右室沿右室長(zhǎng)軸置入1.9F 壓力容積導(dǎo)管。手術(shù)過程中持續(xù)泵注復(fù)方電解質(zhì)注射液（10 mL·kg-1·h-1）維持血容量，調(diào)節(jié)并維持體溫在37℃～38℃。

手術(shù)操作完成血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后，采集基礎(chǔ)值數(shù)據(jù)，兩組大鼠分別梯度吸入0.5%、1.0%、1.5%濃度七氟烷，每個(gè)濃度均吸入30 min。每個(gè)濃度下呼末麻醉氣濃度穩(wěn)定于預(yù)設(shè)值15 分鐘后開始記錄數(shù)據(jù)，每5 分鐘為一個(gè)時(shí)點(diǎn)，選取大鼠機(jī)控呼吸暫停、血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后10～20 個(gè)連續(xù)周期進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。所有數(shù)據(jù)通過PowerLad 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)持續(xù)采集，并通過LabChart 軟件進(jìn)行分析和存儲(chǔ)，得到以下數(shù)據(jù)：心率（HR）、右室收縮末壓力（RVSP）、右心室壓力最大上升速率（dP/dt max）、右室每搏量（SV）、右室心輸出量（CO）、右室射血分?jǐn)?shù)（EF）、肺動(dòng)脈有效彈性（Ea）等。

1.4 右心室肥厚指標(biāo)測(cè)量及組織形態(tài)學(xué)觀察

血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后立即處死大鼠，快速分離心臟，放入-20℃冰箱內(nèi)速凍15 分鐘后取出，于心臟中段沿心室橫軸切2 mm 厚切片，選取最佳切面（心室乳頭肌平面）進(jìn)行拍照，并用Image-Pro Plus軟件分析右、左心室室壁厚度，計(jì)算得出右/左室室壁厚度比值（R/L 室壁厚度）。拍照后將心臟右室游離壁（RV）、左心室和室間隔（LV+S）完整分離并分別稱重，計(jì)算心臟重量（HW）、右心室質(zhì)量指數(shù)（RVMI）=RVW/BW、右室肥厚指數(shù)（RVHI）=RV/（LV+S）。剪取部分右室心肌組織放入4%多聚甲醛內(nèi)固定，依次常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片及蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理改變并采集圖片。

1.5 Western blot 檢測(cè)右室心肌中 iNOS 及 sGC 的表達(dá)

取右室心肌組織勻漿，離心后取上清液，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。每例取50 μg 蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；脫脂奶粉封閉后，依次加入一抗（1∶200 兔抗sGCβ1 抗體，1∶200 兔抗 iNOS 抗體，1∶4000 鼠抗β-actin 抗體）及HRP 標(biāo)記的二抗（1∶4000 羊抗兔或羊抗鼠）；ECL顯影，掃描膠片，用graph pad 圖像分析軟件進(jìn)行灰度掃描分析，同時(shí)以β-actin 作為內(nèi)參照，計(jì)算目的蛋白表達(dá)的百分率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，應(yīng)用SPSS 19 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組大鼠形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)及相同時(shí)點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。兩組大鼠術(shù)中不同時(shí)點(diǎn)血液動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)組間比較采用重復(fù)測(cè)量單因素方差分析，血流動(dòng)力學(xué)變化幅度的比較采用Z檢驗(yàn)（n＞40）；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 右心室肥厚結(jié)果

兩組大鼠右室肥厚測(cè)量結(jié)果如表1 所示，與C 組大鼠比較，M 組大鼠平均體重（BW）降低，RVMI、RVHI 及R/L 室壁厚度均明顯增加。心臟組織肉眼觀可見M 組大鼠右心室游離壁較C 組明顯增厚，右心室內(nèi)乳頭肌和肉柱亦顯著增粗（圖1）。

表1 兩組大鼠右室肥厚測(cè)量結(jié)果（n=15，±s）

2.2 右室心肌組織病理改變

HE染色結(jié)果顯示：C組大鼠右室心肌纖維排列整齊，胞漿染色均勻，胞核大小均一（圖2A、2C）；M 組大鼠右室心肌纖維排列紊亂，間隙增寬，細(xì)胞肥大增粗，胞核大小不一，心肌間質(zhì)纖維增生，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2B、2D）。

2.3 血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果

兩組大鼠吸入不同濃度七氟烷時(shí)主要血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示在表2 中。從基礎(chǔ)值可以看出，M 組大鼠 RVSP、Ea、dP/dtmax 均明顯高于 C 組，而兩組大鼠間MAP、HR、CO、SV、EF 均無明顯差異。

隨著七氟烷吸入濃度遞增，兩組大鼠MAP、RVSP、CO、EF、dP/dtmax 逐漸下降，EDV 逐漸增大。C 組大鼠 Ea 無明顯變化，M 組大鼠 Ea 逐漸減小。兩組大鼠吸入不同濃度七氟烷后許多血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化趨勢(shì)相似，但是變化幅度不同。兩組大鼠吸入七氟烷后CO 均下降，但是C 組隨吸入濃度增加而逐漸下降而M 組無此下降趨勢(shì)；兩組EF 和dP/dtmax 均隨七氟烷濃度遞增而逐漸降低，且M 組下降幅度更??；C 組SV 在0.5%時(shí)無明顯變化，在1.0%及1.5%時(shí)下降且有濃度梯度效應(yīng)，M組SV 在吸入七氟烷后下降但無濃度梯度效應(yīng)?？偟膩碚f，七氟烷吸入導(dǎo)致的M 組大鼠dP/dtmax、CO、EF 及 SV 下降幅度均較 C 組小。

表2 兩組大鼠主要血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（n=15，±s）

2.4 右室心肌iNOS 和sGC 含量檢測(cè)結(jié)果

Western blot 結(jié)果（圖3）顯示：梯度吸入七氟烷后，M 組大鼠右室心肌組織中iNOS 表達(dá)高于C組，而sGCβ1 表達(dá)低于C 組。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔單次注射野百合堿建立大鼠右心室肥厚模型，觀察探討了七氟烷吸入對(duì)其右心功能的影響及可能機(jī)制。野百合堿可損傷大鼠的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而引起肺小動(dòng)脈收縮、重塑，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓繼發(fā)右心室肥厚，此方法簡(jiǎn)便有效，因此常被用來建立肺動(dòng)脈高壓和右室肥厚及右心衰動(dòng)物模型［5，6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，M 組大鼠右心室室壁增厚，右室肥厚指數(shù)升高，RVSP、Ea升高；HE 染色結(jié)果亦顯示了心肌肥厚的病理改變，證明大鼠右室肥厚模型建立成功。M 組大鼠RVSP 和Dp/dtmax 高于 C 組，但兩組大鼠 MAP、HR、SV、CO、EF 均無明顯差異，說明 M 組大鼠右室收縮力增強(qiáng)而心臟泵血功能尚處于正常狀態(tài)，右心功能處于代償期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致［3，7］。

七氟烷是臨床常見吸入麻醉藥之一，其可以直接擴(kuò)張?bào)w循環(huán)血管或減低心肌收縮力引起體循環(huán)血壓及阻力下降［8］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示MAP 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)七氟烷濃度梯度依賴性降低。肺動(dòng)脈有效彈性（Ea）可有效反映右室后負(fù)荷，本實(shí)驗(yàn)中吸入七氟烷后M 組大鼠Ea 減小而C 組大鼠Ea 無明顯變化，提示七氟烷可降低右室肥厚大鼠的右室后負(fù)荷但對(duì)正常大鼠無明顯影響。以往的一些實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在生理及病理情況下七氟烷不會(huì)影響肺動(dòng)脈壓-血流關(guān)系，不影響右室后負(fù)荷［3，9，10］?？紤]到不同實(shí)驗(yàn)中選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、樣本量及吸入麻醉藥濃度不同，本實(shí)驗(yàn)得出的較低濃度七氟烷可以降低右室肥厚大鼠的右室后負(fù)荷這一結(jié)果對(duì)后續(xù)研究有一定參考價(jià)值，需進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。既往有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥會(huì)損傷右室收縮功能，且與劑量相關(guān)［9，11］。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)七氟烷會(huì)損傷兩組大鼠的右室收縮功能，并呈濃度依賴性，但右室肥厚大鼠損傷程度相對(duì)正常大鼠較輕。吸入1.5%七氟烷時(shí)，C組大鼠右室SV、CO 和EF 分別下降了22%、39%和43%，而M 組大鼠右室SV、CO 和EF 分別下降了13%、18%和9%，說明本實(shí)驗(yàn)中右室肥厚大鼠具有良好的心功能代償機(jī)制。

生理情況下心肌中iNOS 表達(dá)很低，在心肌受到氧化應(yīng)激等刺激下其表達(dá)可顯著增加，進(jìn)而催化生成大量 NO，NO 可與 sGC 結(jié)合，催化 GTP 生產(chǎn)cGMP，激活PKG 等通路，下調(diào)肌絲對(duì)Ca2+的敏感性，進(jìn)而產(chǎn)生負(fù)性肌力作用［12］；此外，iNOS 上調(diào)導(dǎo)致的大量的氧自由基生成可使sGC 降解增加，表達(dá)下降［13，14］。許多肺動(dòng)脈高壓及右室肥厚動(dòng)物模型可觀察到iNOS 表達(dá)上調(diào)及sGC 表達(dá)下調(diào)，本研究前期實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了該現(xiàn)象［15，16］。七氟烷暴露可以增加氧自由基或羥基生成從而使sGC 脫敏，表達(dá)下調(diào)［17，18］，但其對(duì) iNOS 的作用尚無定論，且目前尚無七氟烷影響右室肥厚動(dòng)物iNOS 表達(dá)的明確證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠吸入七氟烷后心功能抑制作用比正常大鼠更小，可以用sGC 表達(dá)減少來合理解釋，sGC 表達(dá)下調(diào)可增強(qiáng)心肌細(xì)胞對(duì)Ca2+的敏感性，心肌收縮力增強(qiáng)。sGC 表達(dá)下調(diào)可能是七氟烷吸入或iNOS 表達(dá)增加的直接作用，但七氟烷是否通過增加iNOS 表達(dá)進(jìn)而影響sGC 的表達(dá)尚需進(jìn)一步探討。

綜上所述，60 mg·kg-1野百合堿單次腹腔注射可成功誘導(dǎo)SD 大鼠右心室肥厚，低濃度七氟烷可抑制SD 大鼠的右心功能，但右室肥厚大鼠較正常大鼠表現(xiàn)出更好的耐受性，這可能與心肌中iNOS表達(dá)增加及sGC 表達(dá)減少有關(guān)。