周期素依賴性激酶10在口腔鱗癌中的表達及其臨床意義

劉倩峰 龐 超 楊佩璇 李慶星 牛英豪

口腔鱗狀細胞癌（口腔鱗癌）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，轉移和放化療耐受是口腔鱗癌致死的主要原因[1，2]。因此，闡明口腔鱗癌細胞轉移和放化療耐受的分子調控機制將為設計診斷用生物標志物、驗證藥物治療的分子靶點和明確切實有效的處理方案奠定實驗基礎。作為細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）家族成員之一，細胞周期素依賴性激酶10 在多種癌癥中起到關鍵的調控作用，CDK10 表達缺失造成腫瘤細胞出現惡性生長并出現轉移[3，4]。本研究應用免疫組織化學法檢測在口腔鱗癌組織中CDK10 蛋白的表達狀態(tài)，研究CDK10 表達與臨床病理參數和生存期之間的相關性。

資料和方法

1.臨床樣本：收集在20011 年11 月至2012 年12 月收治的原發(fā)口腔鱗癌組織手術標本208 例，整理臨床病理資料并進行電話回訪?；颊吣挲g最大71歲，最小32 歲，中位年齡50.2 歲。根據美國癌癥聯(lián)合委員會腫瘤淋巴結轉移（tumor node metastasis，TNM）標準（第六版）分期。入組標準：①樣本均經病理組織學確診；②臨床病理和預后資料齊全；③術前未行放化療和生物治療。排除標準：合并有其它種類惡性腫瘤。

2.主要試劑：兔抗人多克隆抗體（CDK10、P53 和Ki67）購自美國Santa Cruz 公司，EnVision 通用性試劑盒購自上海長島生物技術有限公司，DAB 試劑購自中山金橋生物技術有限公司。

3. 免疫組織化學染色：用4%中性甲醛固定樣本，石蠟包埋后4μm 厚度切片，二甲苯逐級脫蠟，梯度乙醇回水；3% H2O2溶液滅活內源性過氧化物酶；采用10mmol/L EDTA（pH 9.0）微波抗原修復；一抗（1:200 稀釋）4℃過夜；按EnVision 二步法說明書進行染色，DAB 顯色10min，蘇木素復染2min，鹽酸乙醇分化；脫水，透明后封固。PBS 替代一抗作為空白對照。

4. 免疫組化染色判定：CDK10 表達狀態(tài)判定標準如下[5]：以細胞核出現明顯的黃色至棕黃色顆粒為陽性信號。采用染色強度和陽性細胞數記分乘積的計算規(guī)則。免疫組化染色強度判斷方法：0 分為沒有著色，1 分為淺黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。高倍鏡下（×400）選擇10 個視野計算癌細胞的陽性染色百分率：0 分為無染色，1 分為1%～25%細胞2 分為6%～50%染色，3 分為51%～75%，4 分為76%～100%。染色強度分數與陽性細胞百分率記分乘積為最終評分，低表達為1～3 分，陽性染色定義為為≥4 分。P53 和Ki67 表達狀態(tài)判定：細胞核無著色為0 分、1 分為＜1%細胞染色、2 分為1%～10%、3 分為11%～33%細胞染色、4 分為34%～66%細胞染色、5 分為≥67%細胞染色，染色強度按無、弱、中、強分別評為0、1、2、3 分。二者之和，≤2 分為染色陰性，＞2 分為染色陽性。

5.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗，生存期分析采用Kaplan-Meier 法和log rank 檢驗。單因素分析和多因素分析采用COX 風險比例模型，確立影響患者的獨立預后因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.CDK10 蛋白表達與患者臨床病理參數的聯(lián)系：口腔鱗癌組織中CDK10 蛋白主要表達于腫瘤細胞的細胞核（圖1）。在208 例臨床樣本中103 例為CDK10 為呈陰性表達（49.5%），105 例呈陽性表達（50.5%）。CDK10 表達在臨床TNM 分期Ⅲ/Ⅳ高于Ⅰ/Ⅱ期期（P＝0.035），在淋巴結轉移組（N1-N3）高于無淋巴結轉移組（N0）（P＝0.042），在T3/T4 組高于T1/T2 組（P＝0.019）。CDK10 表達與患者年齡、組織學分級、P53 和Ki67 表達狀態(tài)等臨床病理參數無關（表1）。

2.CDK10 蛋白表達與患者預后的關系：應用Kaplan-Meier 法研究CDK10 表達與患者總生存期之間的關系發(fā)現，CDK10 在癌組織中陰性表達的患者總生存期顯著高于CDK10 陽性表達的患者（P＝0.003）（圖2）。

圖1 口腔鱗癌組織中CDK10 蛋白陽性表達（EnVision×200）

表1 口腔鱗癌組織中CDK10 表達與患者臨床病理參數的關系

3.CDK10 表達與口腔鱗癌預后參數的關系：COX 風險比例模型分析影響口腔鱗癌患者總生存期之間的因素。單因素分析顯示，CDK10 表達（P＝0.004）、性別（P＝0.010）、組織學分級（P＜0.001）、臨床TNM 分期（P＜0.001）、T 分期（P＜0.001）、N 分期（P＜0.001）、P53 表達（P＝0.027）與患者總生存期相關。多因素分析顯示，組織學分級（P＝0.029）和臨床TNM 分期（P＝0.070）是影響患者總生存期的獨立因素。

圖2 Kaplan-Meier 法分析CDK10 表達與患者總生存期的關系（P＝0.003）

表2 COX 風險比例模型單因素和多因素分析

討 論

口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈迅速上升，轉移是導致病人死亡的最主要原因之一。人乳頭瘤狀病毒感染、吸煙均是提高口腔鱗癌的流行病學危險因素。不同的病理性因素導致的口腔鱗狀上皮細胞的基因調控異常，包括細胞基因突變、DNA 錯配修復和細胞周期改變，多種因素共同導致口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。近年來研究口腔鱗癌發(fā)病和進展的分子機制成為預防和臨床治療口腔鱗癌的主要著眼點。細胞周期素依賴性激酶（CDK）與細胞周期性蛋白（cyclins）、細胞周期素依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）三者相互作用成為調控真核細胞周期的關鍵機制。CDK10 基因全長9.7Kb，含有13 個外顯子，定位于人染色體16q24.3，編碼360 個氨基酸，其蛋白分子量大約40kD[6～8]。CDK10 被證明是一類參與調節(jié)細胞周期并廣泛表達于人體組織器官的絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與神經發(fā)育、肝臟纖維化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理與病理過程。

研究發(fā)現依賴于雌激素受體（estrogen receptor）的存在，CDK10 基因失活誘導乳腺腫瘤細胞對選擇性雌激素受體調節(jié)劑他莫西芬出現耐藥[9，10]。在乳腺癌、肝癌和膽管癌中的研究中證實CDK10 在腫瘤組織和腫瘤細胞中表達水平減弱，與腫瘤淋巴結轉移、臨床分期和不良總生存期密切相關，可作為預后評估的獨立因素[11～13]。最新研究表明，胃癌組織中CDK10 表達缺失同胃癌淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期、組織學分級和不良總生存期顯著相關，多因素分析顯示CDK10 表達可作為預后判斷的獨立因子[14]。此外，功能試驗證實肝細胞癌中miR-3127-5p通過靶向抑制抑癌基因Cdk10 從而促進肝癌細胞侵襲及遷移[15]。在膠質瘤的一項研究中，CDK10 通過調節(jié)轉錄因子Snail 的表達而影響腫瘤細胞轉移與侵襲[16]。后續(xù)研究明確了CDK10 與ETS2 相互作用的分子機制，即活化型CDK10（CDK10/cyclinM）磷酸化ETS2 使其被蛋白酶體識別并降解[17]。

本研究應用免疫組化研究發(fā)現CDK10 表達與口腔鱗癌淋巴結轉移、臨床分期、患者性別、組織學分級顯著相關，提示CDK10 是參與口腔鱗癌發(fā)展的關鍵調節(jié)因子。結合隨訪資料進一步統(tǒng)計發(fā)現CDK10 表達高的口腔鱗癌患者總生存期時間減少。這些研究結果提示，CDK10 可能在口腔鱗癌進展中發(fā)揮類似于癌基因的作用，這同以往在其他類型腫瘤中的研究不同。CDK10 作為一種獨特的細胞周期素依賴性激酶，在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用具有差異性，這可能和腫瘤組織來源和腫瘤細胞微環(huán)境的不同有關。擴大臨床檢測樣本量、進行細胞與動物實驗并深入分析其分子調控機制是探索CDK10 在口腔鱗癌中具體作用的研究方向。

此外，Ki67 作為一種與有絲分裂密切相關的刺激細胞增生相關核抗原因子，是重要的癌癥診斷和生存期評估的分子參數[18～20]。但是本研究顯示CDK10表達與Ki67 表達無顯著相關，可能因為CDK10 調控的分子通路在不同種類腫瘤中表現差異。p53 是已發(fā)現的關鍵的腫瘤抑制基因，通過眾多不同的細胞信號轉導路徑調節(jié)細胞正常細胞活動。此外，p53基因與細胞內其它信號調控因子的相關作用，能夠通過其磷酸化、乙?；凹谆刃揎椷^程，提高癌細胞的錯配修復能力，阻斷DNA 的復制，促進細胞的發(fā)生凋亡。在人類超過半數的多種腫瘤組織中出現了異常的p53 基因突變，被認為是癌癥發(fā)生過程中最重要的分子改變[21～23]。，由于p53 基因突變后其三維分子構象出現變化，喪失了其正常調控細胞生長、細胞凋亡和核酸修復的功能。本研究顯示CDK10 表達與p53 表達無顯著相關，提示CDK10作為一種獨特的分子可能發(fā)揮復雜的調控作用。在對于CDK10 的研究中不能單獨抽象地觀察其基因調控的復雜作用，而是應該從全局整合其功能。

綜上所述，CDK10 表達同口腔鱗癌臨床病理特征和患者預后密切相關，可能是參與口腔鱗癌發(fā)展的遺傳事件。闡明CDK10 表達與口腔鱗癌臨床病理特定關系以及對患者生存期的，不僅有助于改善口腔鱗癌臨床診斷的準確性，而且可以提供更為敏感高效的口腔鱗癌預后評價指標，指導個體化治療方案醫(yī)生的制定，從而改善口腔鱗癌的臨床治療現狀。