藍(lán)莓花青素對鎘致小鼠心臟損傷的改善作用

龔 頻， 高浩天， 楊文娟， 常相娜

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

重金屬鎘是環(huán)境中主要的有毒元素和人體致癌物質(zhì)，是生物濃度因子(BCF)大于100的第二大危險金屬.世界衛(wèi)生組織允許飲用水中的鎘濃度為0.005 mg/L，但由于這種金屬的工業(yè)實用性，實際含量遠(yuǎn)超此標(biāo)準(zhǔn)[1].少量的鎘暴露就能產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷[2]，且鎘的生物半衰期長達(dá)20～30年，極易通過食物鏈在人體中長期蓄積[3].動物體內(nèi)的鎘暴露會導(dǎo)致代謝紊亂的可怕癥狀，引發(fā)高血壓和心臟毒性[4]，鎘毒性是造成人體心肌梗塞、外周動脈疾病、高血壓和動脈粥樣硬化等各種心血管疾病的獨立危險因素[5].

研究表明多種心血管疾病的發(fā)生均與脂肪酸代謝的改變有關(guān)[6]，脂質(zhì)代謝異常產(chǎn)生的脂毒性是造成心血管疾病、動脈粥樣硬化的原因之一.游離脂肪酸的代謝異常與高血壓、冠心病的發(fā)生發(fā)展及心衰的心肌能量代謝異常有明顯的相關(guān)性[7].游離脂肪酸作為機(jī)體的一種能量物質(zhì)，其代謝異?？梢鹬|(zhì)代謝紊亂，是代謝綜合癥發(fā)病的一個十分重要的因素[8]，而脂質(zhì)代謝紊亂又是引起動脈粥樣硬化的重要危險因素[9].有多項研究表明鎘對心臟具有毒性作用[10]，其毒性機(jī)制與鎘誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxides，LPO)增加、心肌細(xì)胞凋亡和衰老[2,11]相關(guān).鎘暴露還能夠?qū)е滦呐K內(nèi)皮細(xì)胞壞死，進(jìn)而引起心肌缺血.心肌缺血會使交感腎上腺素能系統(tǒng)的活動增強(qiáng)，血中兒茶酚胺增高，導(dǎo)致蛋白脂酶的活性增加，內(nèi)生性脂解作用增強(qiáng)，使游離脂肪酸增加，進(jìn)一步引起“脂毒性”，加劇鎘對心臟的損傷作用.

尋找一種能夠有效防治鎘引起心臟毒性的功效成分迫在眉睫，藍(lán)莓花青素是一種類黃酮的多酚色素，具有抗氧化、抗炎、抗微生物、保護(hù)心血管等作用，可調(diào)節(jié)各種代謝途徑來維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12]，定期食用類黃酮可降低死亡率，食用富含藍(lán)莓花青素的食物可調(diào)節(jié)血脂血壓，降低罹患心血管疾病的風(fēng)險，藍(lán)莓果實富含藍(lán)莓花青素，健康人群連續(xù)一個月每日食用200 g藍(lán)莓，能夠有效改善血管功能、降低血壓，效果可與降壓藥相媲美[13].歐洲和亞洲已經(jīng)將服用藍(lán)莓花青素用于治療動脈粥樣硬化[14,15].藍(lán)莓花青素具有較強(qiáng)的自由基清除能力，可清除機(jī)體中大量的自由基，可以用作抗氧化劑，抑制低密度脂蛋白和高密度脂蛋白被氧化，從而減輕動脈粥樣硬化的發(fā)生，發(fā)揮保護(hù)心血管的作用[16].花青素具有明顯的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和改善動脈粥樣硬化的作用，這可能與花青素激活膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)而促進(jìn)膽固醇的代謝有關(guān)[17,18].此外，在內(nèi)皮細(xì)胞中加入花青素可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[19.20].花青素還能夠增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)[21,22].因此藍(lán)莓花青素可作為一種治療鎘致心臟損傷的潛在藥物.

本研究基于GC-MS技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法研究藍(lán)莓花青素對鎘致小鼠心臟組織脂質(zhì)代謝物的影響，利用XCMS軟件對采集得到的總離子流圖進(jìn)行峰識別、峰對齊、峰匹配和峰強(qiáng)度校正等操作，將結(jié)果轉(zhuǎn)化為化合物的保留時間和峰面積信息.通過SIMCA-P11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘分析(PLS).利用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物標(biāo)志物的鑒定.通過比較其脂質(zhì)代謝物水平的差異，探討藍(lán)莓花青素對鎘致小鼠心臟損傷的保護(hù)作用，并初步闡釋其作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物：雄性昆明小鼠(SPF級)，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，體重(20±2) g，動物生產(chǎn)許可證號 SCXK(陜)2017-003.

藥品與試劑：藍(lán)莓花青素，大興安嶺林格貝有機(jī)食品有限責(zé)任公司；氯化鎘，天津市福晨化學(xué)制劑廠；十七烷酸，阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司；DMP，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；其他均為分析純.

儀器：電子天平(型號TDL-40B)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；GC-MS，美國安捷倫科技公司.

1.2 動物模型的建立及給藥

雄性昆明小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由取食飲水.隨機(jī)分成空白組、模型組、藍(lán)莓花青素低、中、高劑量組(0.3 mg/kg/d、3 mg/kg/d、30 mg/kg/d)，每組8只.除空白組每天注射，灌胃生理鹽水外，其余各組小鼠腹腔注射CdCl2水溶液(2 mg/kg/d)，其中藍(lán)莓花青素低、中、高劑量組灌胃不同劑量藍(lán)莓花青素溶液，連續(xù)處理14 d.末次給藥后禁食12 h，小鼠斷頸處死，迅速取出心臟，于-80 ℃冰箱保存.

1.3 配制內(nèi)標(biāo)溶液

稱取1 mg十七烷酸酯，用甲醇配制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液，待用.

1.4 樣品的前處理

取心臟組織10 mg，加入1 mL DMP與濃HCl的混合溶液(每毫升混合液含20μl濃HCl)，渦旋3～5 min，制備混懸液.再加十七烷酸內(nèi)標(biāo)液20μl，通氮氣10 s，搖床振蕩20 min(25 ℃，150 r/min)，反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干.向干燥殘渣中加1.5 mL含5%無水HCl的甲醇溶液，80 ℃水浴加熱2～4 h，向樣品中加等體積去離子水，石油醚萃取，振蕩混勻，取石油醚層，加無水Na2SO4干燥，過濾，真空干燥，通氮氣10 s，樣品冷凍待檢測.

1.5 分析條件

色譜條件：載氣為氦氣，流速為1.5 mL/min，自動進(jìn)樣1μl，不分流.進(jìn)樣口溫度為290 ℃，初始柱溫60 ℃，維持4 min后，以5 ℃/min升溫至150 ℃，再以4 ℃/min升溫至300 ℃，維持25 min.

質(zhì)譜條件：EI離子源，正離子檢測，電離能70 eV，離子源溫度230 ℃，檢測器溫度150 ℃，電子倍增器電壓1 070 V，溶劑延遲3.75 min，掃描方式為全掃描方式.

1.6 數(shù)據(jù)采集及分析

采用GC-MS對樣本進(jìn)行檢測，得到樣品總離子流色譜圖，利用XCMS軟件對采集得到的譜圖進(jìn)行峰識別、峰對齊、峰匹配和峰強(qiáng)度校正等操作，將結(jié)果轉(zhuǎn)化為化合物的保留時間和峰面積信息，將其導(dǎo)入SIMCA-P11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)，用于觀察樣本的聚集與離散程度；偏最小二乘法PLS能顯示組間差異.PCA結(jié)果用散點圖來顯示，其代表樣本的離散程度，離散越接近表示含有相似的代謝組分.PLS用于鑒定組別.根據(jù)VIP值篩選差異代謝物，并利用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗，顯著性水平設(shè)為P<0.05，利用NIST代謝物數(shù)據(jù)庫，二級質(zhì)譜及標(biāo)準(zhǔn)品對照進(jìn)行生物標(biāo)志物的鑒定.

2 結(jié)果與討論

2.1 鎘暴露小鼠心臟脂肪酸鑒定

對鎘暴露小鼠心臟組織樣品進(jìn)行GC-MS分析，得到總離子流色譜圖，結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出，保留時間10 min后開始出峰，15～37 min檢測出較多物質(zhì).通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間及質(zhì)譜圖對比，可對色譜峰進(jìn)行鑒定.

圖1 小鼠心臟脂肪酸總離子流圖

2.2 組間代謝差異分析

PCA是一種無監(jiān)督的模式識別分析方法，可在多維空間對樣本間差異進(jìn)行直觀顯示.圖2為小鼠心臟組織PCA得分圖.由圖2可以看出，通過PCA分析游離脂肪酸(FFA)的自動標(biāo)定數(shù)據(jù)，各組組內(nèi)樣品分布密集，差異很小.空白組、模型組、藍(lán)莓花青素保護(hù)組的代謝表現(xiàn)有一定的區(qū)分，說明心臟代謝產(chǎn)物存在差異.其中，空白組與模型組完全分離，表明CdCl2暴露會損傷小鼠心臟的正常生理功能.

為了更好地對空白組、模型組、藍(lán)莓花青素保護(hù)組的心臟組織代謝譜圖進(jìn)行分型，需要借助其他多變量模式識別方法.PLS是一種有監(jiān)督的模式識別方法，目的是建立類別間的數(shù)學(xué)模型，使樣本間達(dá)到最大分離.

圖3是小鼠心臟組織的PLS圖.由圖3可知，從空間位置上來看，模型組與空白組組織標(biāo)本之間分開趨勢良好，相互遠(yuǎn)離，差異明顯，且組內(nèi)樣品相對聚集，差異較小，表明模型組小鼠心臟代謝物與空白組相比發(fā)生了明顯變化，鎘暴露可能對小鼠心臟組織的正常功能產(chǎn)生影響，模型構(gòu)建成功；再從空間位置上來看，藍(lán)莓花青素各保護(hù)組介于空白組和模型組之間，且藍(lán)莓花青素各保護(hù)組小鼠心臟樣品中的代謝散點趨向空白組，提示藍(lán)莓花青素各劑量對小鼠損傷心臟產(chǎn)生一定程度的保護(hù)作用，其中高劑量組距離空白組最近，說明高劑量組的保護(hù)效果最明顯.

K為空白組；A、B、C為低、中、高劑量組；S為模型組圖2 小鼠心臟組織PCA得分圖

K為空白組；A、B、C為低、中、高劑量組；S為模型組圖3 小鼠心臟組織PLS圖

2.3 潛在生物標(biāo)記物的確定

根據(jù)比較模型組與空白組的GC-MS結(jié)果，獲得幾種變化顯著的脂肪酸，這些變化顯著的脂肪酸可能作為鎘誘導(dǎo)心臟損傷的潛在生物標(biāo)志物.這些物質(zhì)的分子量可以通過圖4的質(zhì)譜圖確定，通過NIST08軟件對可能的結(jié)構(gòu)式進(jìn)行模擬計算，在NIST代謝物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和標(biāo)準(zhǔn)品對照，確定圖4中物質(zhì)的種類.

結(jié)果顯示，脂肪酸生物標(biāo)記物為圖4(a)棕櫚酸、圖4(b)硬脂酸、圖4(c)亞油酸、圖4(d)花生四烯酸、圖4(e)二十碳五烯酸和圖4(f)二十二碳六烯酸.

(a)C16∶0 棕櫚酸

(b)C18∶0 硬脂酸

(c)C18∶2 亞油酸

(e)C20∶5 二十碳五烯酸

(f)C22∶6 二十二碳六烯酸圖4 潛在生物標(biāo)記物的質(zhì)譜圖

通過檢索代謝物數(shù)據(jù)庫，并通過二級質(zhì)譜和標(biāo)準(zhǔn)品對照確定了變化顯著的6種脂肪酸，其結(jié)果如表1所示.由表1可知，與空白組相比，模型組小鼠心臟組織中亞油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸含量減少(P<0.05)，其中二十二碳六烯酸含量下降最多，含量僅為空白組的62%，亞油酸減少了29%，二十碳五烯酸減少了24%；而棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸含量增加(P<0.05)，其中硬脂酸含量增加最多，含量為空白組的3.19倍，而棕櫚酸增加了2.03倍，花生四烯酸增加了1.85倍.說明鎘的攝入已經(jīng)嚴(yán)重影響到了小鼠正常的生理功能，引起了小鼠心臟組織嚴(yán)重的代謝紊亂，造成了可怕的脂毒性.已有研究表明，棕櫚酸可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，其在人體內(nèi)含量升高會加劇罹患冠心病的風(fēng)險[23,24]；硬脂酸能引起低密度脂蛋白含量升高并導(dǎo)致冠心病[25,26]；花生四烯酸在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)同時引發(fā)動脈粥樣硬化[27,28].鎘毒性暴露能夠顯著增加這三種脂肪酸的含量，表明鎘通過紊亂脂質(zhì)代謝，從而增加了機(jī)體心臟的損傷；此外，亞油酸具有降血脂作用[29]；二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸對線粒體的合成、抗氧化酶表達(dá)和氧消耗效率有益[30].這些有益的不飽和脂肪酸的減少，也驗證了鎘毒性暴露通過干擾正常的脂質(zhì)代謝水平，導(dǎo)致心臟損傷增加.

在給予藍(lán)莓花青素后，藍(lán)莓花青素能夠顯著地改善脂質(zhì)代謝紊亂的狀況，其中，下調(diào)機(jī)體心臟組織中棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸含量，分別減少為模型組的75%、64%和91%，同時，對有益的不飽和脂肪酸含量也起到了調(diào)節(jié)作用，增加了亞油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸含量，分別增加了1.73、1.29和1.67倍，該結(jié)果說明藍(lán)莓花青素增加了心臟組織中有益不飽和脂肪酸的比例并減少了飽和脂肪酸的量.進(jìn)一步說明藍(lán)莓花青素通過改善脂質(zhì)代謝紊亂、調(diào)節(jié)心臟組織中鎘毒性造成的脂毒性，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用.Crespo等[31]指出藍(lán)莓具有抑制心臟代謝紊亂的潛力，攝入花青素可以降低心血管疾病和高血壓的風(fēng)險.Wu等[32]發(fā)現(xiàn)喂食藍(lán)莓汁可以減少高脂飲食下小鼠體內(nèi)的脂肪蓄積.Graf等[33]給予大鼠富含花青素的葡萄越橘汁，發(fā)現(xiàn)灌胃后大鼠血漿中的不飽和脂肪酸含量增加，同時飽和脂肪酸含量減少，藍(lán)莓花青素能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的脂質(zhì)代謝，這與本實驗的結(jié)果一致.

表1 心臟組織潛在脂肪酸生物標(biāo)記物

3 結(jié)論

本研究通過建立鎘致小鼠心臟損傷模型，基于GC-MS技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)鎘暴露后小鼠心臟組織脂肪酸代謝異常，并確定了6種潛在生物標(biāo)記物，棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸、亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸.在經(jīng)藍(lán)莓花青素處理后小鼠心臟各項脂肪酸指標(biāo)均趨向于正常組別，藍(lán)莓花青素通過改善了脂質(zhì)代謝紊亂，對鎘致心臟損傷起到一定的保護(hù)作用.此外，由于鎘毒性能夠引起脂肪酸的異常變化，因此，某些特殊的脂肪酸可作為鎘毒性的特征生物標(biāo)志物，用于鎘中毒的預(yù)防及防治.