限制性酶解-超高壓處理對米渣蛋白乳化性的影響

劉 寧， 楊柳怡， 齊雅墨， 龍 肇

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

0 引言

大米在我國不僅是一種主食，也是用于制備糖漿、發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的原料，其下腳料米渣中含有40%～70%的蛋白質(zhì).米渣蛋白的保健功能近年來受到廣泛關(guān)注，具有預(yù)防糖尿病、降低膽固醇含量的保健作用，以及抗癌等功效[1].但米渣蛋白的乳化性、溶解性等功能特性較差，限制了其在食品工業(yè)的應(yīng)用.因此，通過改性手段提高米渣蛋白的功能特性，具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值.

酶解是利用蛋白酶將蛋白轉(zhuǎn)化成較小分子從而使功能性質(zhì)發(fā)生定向改變的方式.由于其作用溫和，酶解后的營養(yǎng)物質(zhì)易被消化吸收而被廣泛關(guān)注.史洲銘等[2]利用木瓜蛋白酶酶解南極磷蝦蛋白，發(fā)現(xiàn)酶解顯著改善了南極磷蝦蛋白的吸油性、乳化性、起泡性等，提高了南極磷蝦蛋白的應(yīng)用范圍.Thaiphanit等[3]和Li等[4]采用堿性蛋白酶對椰子蛋白、玉米蛋白進(jìn)行限制性酶解，所得酶解物具有較好的乳化性和溶解性.

超高壓(High hydrostatic pressure，HHP)是一種非熱處理技術(shù)，如今在食品，醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)展迅速，具有廣闊的應(yīng)用前景[5,6]，相對于熱處理來說更為柔和，其壓力一般為100～1 000 MPa[7]，可將樣品密封袋置于高壓腔中，選擇水或其他流體作為傳壓介質(zhì).超高壓一般不會(huì)對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，但會(huì)改變其非共價(jià)鍵和較弱的化學(xué)鍵以及分子間作用力[8].一般來說，超高壓處理可使食品內(nèi)部的部分結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及生物活性發(fā)生一定程度的改變.由于其較強(qiáng)的可操作性、可控制性，及其環(huán)保綠色的處理方式，成為一項(xiàng)極具潛力的加工處理手段[9,10].

本文在限制性酶解的基礎(chǔ)上聯(lián)合超高壓改性法，研究不同處理手段對米渣蛋白乳化性的影響，以期為米渣資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米渣蛋白(蛋白含量為85.2%)，無錫金農(nóng)生物科技有限公司；AP-200A堿性蛋白酶，安琪酵母股份有限公司；大豆油，中糧集團(tuán)食品有限公司；磷酸氫二鈉，天津天力化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉，天津天力化學(xué)試劑有限公司；Tris，北京博奧拓達(dá)公司；十二烷基磺酸鈉，生工生物工程(上海)有限公司；尿素，北京天力公司；ANS熒光探針，梯希愛化成工業(yè)公司.

1.2 儀器與設(shè)備

L-600/3型食品高壓處理設(shè)備，天津市華泰森淼超高壓設(shè)備有限公司；101-2型電鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；BP211D型電子天平，德國Sartorius公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；TDL-40B型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV2900紫外可見光分光光度儀，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；T10 Basic高速剪切分散乳化機(jī)，德國IKA有限公司；ATS-Basic I高壓均質(zhì)機(jī)，加拿大奧維斯汀有限公司；MS2000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；ZS40納米粒度表面電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；DM500高級臺式顯微鏡，德國萊卡微系統(tǒng)有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米渣蛋白分散液的制備

稱取一定質(zhì)量的米渣蛋白溶于10 mmol/L pH 8.0的磷酸緩沖液中，室溫下攪拌3 h，水化過夜，得到蛋白含量為1.0%(w/v)的蛋白分散液.

1.3.2 樣品處理

A未處理.

B僅超高壓[11]：用真空封口機(jī)將配制好的蛋白分散液密封于耐高溫高壓的10 × 20 cm聚乙烯袋中(排除氣泡).置于壓力腔內(nèi)，浸沒到傳壓介質(zhì)水中，設(shè)置壓力、時(shí)間和溫度參數(shù)后進(jìn)行超高壓處理.處理后樣品放置于4 ℃保存，所有性質(zhì)于24 h后進(jìn)行測定，即只考慮不可逆的變化.超高壓處理參數(shù)為：壓力腔夾套溫度設(shè)置25 ℃，壓力范圍200 MPa，處理時(shí)間10 min.

C僅酶解：將米渣蛋白配置成2.0%(w/v)的分散液，加入堿性蛋白酶(酶活為6 000 U/g)，在pH為9.0環(huán)境下，于50 ℃水浴磁力攪拌器中酶解10 min.置于90 ℃水浴滅酶15 min，經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清液凍干備用.

D超高壓后酶解：先以B方法處理后，再經(jīng)C步驟處理(不經(jīng)凍干)，取滅酶后的酶解上清液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

E酶解后超高壓：取C方法酶解后的凍干粉，制成分散液，再經(jīng)B步驟超高壓處理.

1.3.3 乳化性的測定

對經(jīng)1.3.2制備的5種樣品進(jìn)行乳化性的測定，采取Pearce等[12]的方法，稍有改動(dòng).取1%(w/v)的蛋白分散液15 mL與0.15 g大豆油混合，放入離心管中，設(shè)定高速剪切分散乳化機(jī)的轉(zhuǎn)速為10 000 rpm，處理1 min.之后立即用50μL微量進(jìn)樣器吸取離心管底部的液體，與5 mL 0.1%(w/v)SDS溶液用渦旋振蕩器混勻后測定在500 nm波長處的吸光值.按照公式(1)計(jì)算乳化性(EAI)：

(1)

式(1)中：C-樣品濃度(g/mL)；φ-乳化液中油相的比例0.1；A-乳化液最初的吸光值；Dilution-稀釋倍數(shù).

1.3.4 表面疏水性的測定

利用ANS熒光探針法測定樣品疏水性，參考Kato等[13]的方法.

1.3.5 游離巰基含量測定

游離巰基(SH)含量的測定參考劉堅(jiān)[11]的方法.

1.3.6 乳液平均粒徑的測定

參考Sandra等[14]的方法，以不同處理方式后的米渣蛋白制備水包油型乳液.乳液的平均粒徑采用馬爾文激光粒度儀分析測定，以去離子水作為分散劑，設(shè)置參數(shù)如下：通用模式，顆粒折射率1.520，分散劑折射率1.330，泵的轉(zhuǎn)速2 500 r/min.

1.3.7 乳液Zata-電位的測定

Zata-電位的測定參考孔靜[15]的方法，利用馬爾文納米粒度表面電位測定儀進(jìn)行測定.測定前先用10 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋樣品100倍.測定溫度為25 ℃，平衡時(shí)間1 min.

1.3.8 酶解-超高壓處理工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化

以乳化性為考察指標(biāo)，利用SPSS軟件進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，選取堿性蛋白酶酶解時(shí)間、超高壓處理壓力、超高壓處理時(shí)間，設(shè)置3因素3水平，如表1所示.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次取平均值，通過SPSS 16軟件計(jì)算數(shù)據(jù)差異顯著性分析(p<0.05)，通過Origin 8.5軟件作圖分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理方法對米渣蛋白乳化性的影響

實(shí)驗(yàn)研究了經(jīng)5種方法處理后的米渣蛋白乳化性，結(jié)果如圖1所示.由圖可以看出，樣品B經(jīng)超高壓處理，比未處理的樣品A乳化性有所提高.而經(jīng)過限制性酶解的樣品C、E的乳化性也明顯提高，分別達(dá)到20.80 m2/g和23.53 m2/g，樣品E的乳化性最大.這與張晶[16]的研究結(jié)果相近，可能是由于經(jīng)過超高壓或者酶解處理后能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，疏水基團(tuán)和一些亞基暴露，分子量變小，使得更容易分散到油水界面，從而提高了乳化性.

圖1 不同方法處理對蛋白乳化性的影響

2.2 表面疏水性的測定

由圖2可知，與未處理的樣品A相比，其他四組的疏水性均有不同程度的提高.經(jīng)過超高壓處理后，樣品B的疏水性提高，這是由于在超高壓條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得舒展，在展開的過程中使得疏水基團(tuán)進(jìn)一步暴露[17].而蛋白經(jīng)限制性酶解后，肽鏈的氨基酸序列變得更短，疏水基團(tuán)更易暴露于蛋白質(zhì)表面.

圖2 不同處理方式對表面疏水性的影響

2.3 游離巰基含量的分析

經(jīng)過不同方式處理樣品的游離巰基含量如圖3所示.由圖3可以發(fā)現(xiàn)，樣品A的巰基含量為6.25μmol/g，經(jīng)過超高壓的樣品B游離巰基含量下降，蛋白組分發(fā)生解離，其中一部分新產(chǎn)生的游離巰基會(huì)發(fā)生重組，重組的巰基基團(tuán)可能發(fā)生二硫鍵交換反應(yīng)或被氧化，從而使游離巰基含量減少[18].而經(jīng)過酶解處理的樣品中的游離巰基含量都有不同程度的上升，樣品E的上升幅度最高.一般來說，蛋白的游離巰基含量與乳化性呈正相關(guān)[18]，因此，樣品E的乳化性最高.

圖3 不同處理方式對游離巰基含量的影響

2.4 乳液的平均粒徑測定

實(shí)驗(yàn)測定了不同方法處理米渣蛋白所制備水包油型乳液的平均粒徑大小，如表2所示.從測定結(jié)果可知，樣品A的粒徑與其他樣品差距較大.經(jīng)超高壓或酶解單一處理后，樣品的粒徑降低.僅超高壓的樣品B的D43從13.78μm下降到1.71μm，這可能是由于超高壓的處理使得大分子蛋白被破碎成較小的聚合體，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)松散，從而使粒徑減小[19].僅酶解的樣品C的D43下降到0.57μm.樣品E的D43最小，為0.35μm，這是由于酶解和超高壓聯(lián)合處理使米渣蛋白的乳化性更好，乳液呈現(xiàn)最小的平均粒徑.

表2 不同處理方式對乳液平均粒徑的影響

*注：同一列的不同字母表示差異顯著(p<0.05).

2.5 乳液的Zeta-電位分析

通常當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處的pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，反之則帶正電.油滴間斥力大小取決于液滴的表面的電荷量的多少，而Zeta-電位可用來表示液滴的表面電荷量.一般電位的絕對值越大，乳液的穩(wěn)定性越好[20].通過圖4可以看出，所有乳液的電位分布在-25～-32 mV之間，并且，未經(jīng)處理的樣品Zeta-電位絕對值最小，穩(wěn)定性最差，而經(jīng)過限制性酶解-超高壓處理樣品的穩(wěn)定性得到明顯改善，這與乳液的平均粒徑測定結(jié)果一致.

圖4 不同處理方式對乳液Zeta-電位的影響

2.6 限制性酶解-超高壓處理的正交試驗(yàn)優(yōu)化

以酶解時(shí)間、超高壓處理壓力、超高壓處理時(shí)間為變量，以蛋白乳化性(EAI)為考察值，通過正交實(shí)驗(yàn)對限制性酶解-超高壓處理工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如表3所示.

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3中分析結(jié)果可以看出，因素A(酶解時(shí)間)、因素B(超高壓處理壓力)對米渣蛋白的EAI的影響顯著(p<0.05)，因素C(超高壓處理時(shí)間)對EAI的影響不顯著，各因素影響的大小順序?yàn)椋篈>B>C.酶解-超高壓處理的最佳工藝條件為A2B2C2，即酶解時(shí)間10 min、超高壓處理壓力400 MPa、超高壓處理時(shí)間10 min.在該條件下進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果得到，米渣蛋白的EAI為23.8 m2/g.

3 結(jié)論

通過不同方式對米渣蛋白進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)限制性酶解-超高壓處理的效果最佳，經(jīng)處理后米渣蛋白的乳化性顯著提高，疏水性提高，游離巰基含量

增大.經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，得到最優(yōu)處理工藝為堿性蛋白酶酶解時(shí)間10 min，超高壓處理壓力400 MPa，超高壓處理時(shí)間10 min.