花鱸瘦素基因的克隆及低鹽度條件下調(diào)控表達(dá)分析

張沛，溫海深，遲美麗，錢焜

（中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東青島266003）

花鱸瘦素基因的克隆及低鹽度條件下調(diào)控表達(dá)分析

張沛，溫海深，遲美麗，錢焜

（中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東青島266003）

瘦素 （Leptin，Lep）在動物攝食、生長、生殖、免疫、能量平衡等方面具有重要作用，為研究花鱸Lateolabrax maculatus Lep功能，采用cDNA末端快速擴(kuò)增法 （RACE）克隆花鱸LepA cDNA全長序列。急性低鹽度調(diào)控試驗設(shè)置海水組 （鹽度32）、半海水組 （鹽度16）和淡水組 （鹽度0），鹽度調(diào)控24、48、96、144、192 h后測定花鱸肝臟中LepA mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明：LepA cDNA全長序列為643 bp，其中開放閱讀框483 bp，編碼161個氨基酸，其氨基酸序列由信號肽和A、B、C、D 4個α螺旋區(qū)域組成；花鱸LepA氨基酸序列與其他物種同源性較低，但三級結(jié)構(gòu)較為保守；花鱸LepA主要在肝臟中表達(dá)，其次為腦；低鹽調(diào)控48 h時，半海水組與淡水組LepA表達(dá)無顯著性差異 （P＞0.05），但均顯著低于海水組（P＜0.05），分別為海水組的33.38%和26.86%。研究表明，急性低鹽度調(diào)控可降低花鱸LepA表達(dá)水平。

花鱸；瘦素；鹽度；基因克??；基因表達(dá)

瘦素 （Leptin，Lep）是肥胖基因 （OB）編碼的一種蛋白類激素，它在攝食、生長、生殖、免疫、能量平衡等方面具有重要作用［1］。Lep屬于Ⅰ-型螺旋細(xì)胞因子家族，其三維結(jié)構(gòu)特征包括4 個α螺旋［2］。從小鼠中首次發(fā)現(xiàn)并克隆出Lep基因［1］，哺乳動物僅有一種Lep，多數(shù)魚類也只有一種Lep，從部分魚類如斑馬魚 Danio rerio、青鳉Oryzias latipes、鯉Cyprinus carpio、斜帶石斑魚Epinephelus coioides等中獲得了LepA和LepB兩種Lep亞型。哺乳動物中Lep主要由脂肪細(xì)胞合成［1］，而魚類Lep主要由肝臟分泌［3］。研究表明，物種間Lep氨基酸序列高度不保守，但其三級結(jié)構(gòu)和功能保守性較高［4］。哺乳動物和魚類中均發(fā)現(xiàn)Lep可通過與下丘腦中特異受體結(jié)合，進(jìn)而控制食欲［5］，調(diào)控能量消耗［6］，參與機(jī)體的免疫調(diào)控［7］，促進(jìn)細(xì)胞因子生成，對動物生長繁殖和胚胎發(fā)育具有重要作用［8］。目前，Lep在哺乳動物生理、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的作用研究較為深入，其可通過血液游離或與瘦素結(jié)合蛋白結(jié)合的方式，與中樞或外周的受體結(jié)合發(fā)揮作用［9］。有關(guān)Lep在魚類滲透調(diào)控中的作用研究，僅見高鹽度對羅非魚Oreochromis mossambicus LepA表達(dá)的影響報道，并發(fā)現(xiàn)LepA在滲透調(diào)控中發(fā)揮重要作用［10］。

花鱸Lateolabrax maculatus為東北亞特有種類，主要分布于中國、日本和朝鮮的沿海區(qū)域，屬廣溫、廣鹽性淺海近岸中下層魚類，為中國重要的網(wǎng)箱與池塘養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一［11］?；|因其肉質(zhì)鮮美，頗受消費(fèi)者喜愛，社會需求日益增加。目前，有關(guān)花鱸形態(tài)學(xué)和養(yǎng)殖技術(shù)方面的研究較為普遍，而有關(guān)鹽度對花鱸生理影響的研究較少，已有報道表明，不同鹽度下1齡花鱸的生長特性有差異，最適生長鹽度為16～17［12］，但有關(guān)用鹽度調(diào)控花鱸生理分子機(jī)制的研究尚未見報道。本研究中，通過克隆花鱸LepA基因并對其序列進(jìn)行分析，探究了各組織中LepA mRNA的表達(dá)差異及低鹽度調(diào)控后的表達(dá)水平，旨在為研究花鱸Lep功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

試驗用花鱸為山東省青島市膠南近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的同規(guī)格健康花鱸，共78尾，體質(zhì)量為（803.5± 49.8）g，體長為（40.5±1.4）cm。將花鱸在實驗室水族箱中暫養(yǎng)，試驗用水為沙濾自然海水 （鹽度32），淡水為曝氣的自來水，水溫為（17.5± 0.4）℃。

1.2方法

1.2.1樣品的制備 取3尾花鱸，用MS-222麻醉后解剖，取其腸、脾、肌肉、心臟、胃、精巢、肝、鰓、腦、盲腸、頭腎、腎、胸腺、垂體14個組織，組織樣品用液氮冷凍后于冰箱 （-80℃）中保存，用于LepA mRNA組織熒光定量檢測。

1.2.2急性鹽度調(diào)控試驗 將試驗魚暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行鹽度調(diào)控試驗。首先取6尾魚作為初始 （0 h）對照，試驗分為3組：海水組、半海水組和淡水組，每組設(shè)4個平行水族箱（0.6 m×0.8 m×1.0 m），每個水族箱放養(yǎng)6尾魚。海水組鹽度不變，半海水組和淡水組每12 h鹽度分別降低4、8，鹽度降至16、0后保持穩(wěn)定。每天9：00和21：00換水3/4，各鹽度試驗用水以海水和淡水按比例混勻調(diào)溫后加入水族箱。鹽度調(diào)控 24、48、96、144、192 h時，分別從每個水族箱取1尾魚，經(jīng)MS-222麻醉解剖，取其肝臟用液氮冷凍后于冰箱（-80℃）中保存，用于Lep mRNA熒光定量檢測。

1.2.3總RNA的提取和cDNA第一鏈合成 取100 mg組織樣品，用Trizol法提取總RNA，使用Biodropsis BD-1000核酸儀測定RNA濃度，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用PrimerScript RT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，于冰箱 （-80℃）中保存。提取肝臟總RNA，用SmartTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒合成全長克隆cDNA模板。

1.2.4花鱸LepA cDNA片段的克隆 參照近緣魚類Lep氨基酸序列，用 CODEHOP設(shè)計簡并引物［13］（表1）。cDNA片段克隆的PCR反應(yīng)程序：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。用Sagecreation電泳凝膠成像系統(tǒng)分析獲得的目的條帶，目的片段產(chǎn)物利用TIANgel Midi Purification Kit試劑盒進(jìn)行凝膠回收，連接pEASY-T1載體，并轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐抗性固體培養(yǎng)基 （37℃）中過夜培養(yǎng)；用藍(lán)白斑技術(shù)篩選目的細(xì)菌，用氨芐抗性液體培養(yǎng)基將其擴(kuò)大培養(yǎng)，菌體用PCR檢測，挑選陽性菌液送北京華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5花鱸LepA cDNA 5′端和3′端克隆 用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒擴(kuò)增5′端和3′端，根據(jù)獲得的LepA cDNA片段，用Primer 5.0軟件設(shè)計與試劑盒中 UPM匹配的引物 （表1），PCR反應(yīng)程序參照試劑盒說明書，RACE PCR產(chǎn)物測序同片段克隆。用DNAMAN拼接基因3′端和5′端序列后得到基因全長。

表1　花鱸瘦素基因克隆與表達(dá)的引物Tab.1 Primers used for cloning and expressing of seabass LepA

1.2.6LepA基因序列分析 用DNAMAN預(yù)測開放閱讀框并推測氨基酸序列，利用Signal P 3.0軟件分析信號肽，用Scratch程序預(yù)測二硫鍵。預(yù)測的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blast搜索，用DNAMAN將其與其他物種的Lep氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對。選取部分物種 Lep氨基酸序列，用Clustal X和MEGA 4.0軟件以鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用DNAstar中Megalign對魚類Lep氨基酸進(jìn)行一致性分析，用SWISSMODEL中Automated Model程序分析蛋白結(jié)構(gòu)。

1.2.7LepA mRNA的熒光實時定量PCR 根據(jù)LepA cDNA全長序列設(shè)計表達(dá)引物 （表1），以βactin為內(nèi)參基因，檢測花鱸14個組織中LepA mRNA的表達(dá)水平。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用雙蒸水進(jìn)行4倍梯度稀釋，共設(shè)5個梯度，每個梯度設(shè)3個重復(fù)，用SYBR Green Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，在ABI Step One Plus實時定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。采用兩步法，β-actin、LepA PCR反應(yīng)程序：94℃下預(yù)變性30 s；94℃下變性5 s，退火30 s（β-actin PCR 60℃，LepA PCR 62℃），共進(jìn)行40個循環(huán)；溶解步驟。梯度稀釋結(jié)果用Excel軟件分析擴(kuò)增效率。試驗組肝臟mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4倍稀釋后，做3個重復(fù)的熒光定量PCR反應(yīng)。用2-ΔΔCt法處理熒光定量所得數(shù)據(jù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （mean±S.D.）表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1花鱸LepA cDNA全長序列及其蛋白結(jié)構(gòu)分析

克隆得到花鱸LepA cDNA全長序列為643 bp，其中包括483 bp開放閱讀框，共編碼161個氨基酸。序列已經(jīng)提交到 NCBI數(shù)據(jù)庫 （GenBank：KF850511）?；|LepA cDNA序列及推測的氨基酸序列如圖1所示。LepA氨基酸序列包括信號肽和A、B、C、D 4個α螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，兩個保守的半胱氨酸殘基 （圖2）。對魚類Lep氨基酸序列進(jìn)行一致性分析，表明物種間Lep氨基酸序列差異較大，花鱸與斜帶石斑魚一致性較高，為88.9%（表2）。Lep蛋白模擬結(jié)果 （圖3）表明，物種間Lep基因雖存在差異，但其蛋白三維結(jié)構(gòu)相近。

2.2LepA蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于魚類及高等物種Lep氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，鱸形目LepA為一分支，其與鲀形目、鳉形目親緣關(guān)系較近，鮭形目為一支，鯉形目為一支，魚類LepB為一支，高等動物為一支，進(jìn)化樹與傳統(tǒng)分類地位相符 （圖4）。

圖1　花鱸LepA cDNA序列及推測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of seabass LepA gene

圖2　瘦素氨基酸多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of Leps from several fishes

圖3　模擬瘦素蛋白結(jié)構(gòu)*Fig.3 Projected tertiary structure of Leps

表2　魚類瘦素氨基酸序列的一致性Tab.2 Amino acid sequence identity of fish　%

圖4　基于瘦素氨基酸序列的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-Joining tree of the deduced amino acid sequences of the Leps

2.3LepA mRNA的組織表達(dá)模式

以肝臟作為對照因子，計算不同組織 LepA mRNA相對定量表達(dá)模式。結(jié)果顯示：花鱸LepA基因的組織表達(dá)十分廣泛，肝臟中轉(zhuǎn)錄水平最高；腦、垂體、腎臟、盲腸、胃、鰓中表達(dá)量次之；其余組織中表達(dá)量較低 （圖5）。

2.4LepA mRNA在急性低鹽調(diào)控后的表達(dá)規(guī)律

從圖6可見：低鹽調(diào)控48 h，半海水組和淡水組LepA表達(dá)量較0 h時顯著降低 （P＜0.05），且均顯著低于海水組 （P＜0.05），二者的LepA表達(dá)水平分別降至海水組的33.38%和26.86%，但二者間無顯著性差異 （P＞0.05）；調(diào)控96 h后，各試驗組LepA表達(dá)水平較0 h時顯著降低 （P＜0.05），但各組間均無顯著性差異 （P＞0.05）。

圖5　花鱸各組織中LepA mRNA的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of LepA mRNA in tissues of seabass

3 討論

本研究中首次從花鱸中克隆得到LepA cDNA全長序列。多物種Lep氨基酸序列比對結(jié)果表明，花鱸LepA基因符合Lep基因的基本特征，4個α螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)氨基酸序列一致性較高。序列一致性分析表明，物種間Lep cDNA序列和氨基酸序列存在較大差異，這對物種間該基因功能上是否存在差異提出疑問。Lep中有一個由兩個半胱氨酸殘基形成的二硫鍵，物種間三維結(jié)構(gòu)較為保守，說明該二硫鍵在物種進(jìn)化中對Lep蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。魚類與哺乳動物L(fēng)ep氨基酸序列的一致性為13%～25%，低一致性可能預(yù)示Lep在物種間高度進(jìn)化后存在結(jié)構(gòu)差異，進(jìn)而影響其功能。

圖6　低鹽度調(diào)控后LepA mRNA的表達(dá)規(guī)律Fig.6 mRNA expression pattern of LepA after low salinity regulation

基于Lep氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，相對近緣物種為一分支，但整體分布與物種分類地位存在差異，高等動物與鯉形目為一個大的分支，而小鼠與雞的同源性要高于人。這些差異可能是由于物種間Lep氨基酸一級結(jié)構(gòu)低同源性導(dǎo)致的分析誤差，同時也表明，物種間Lep結(jié)構(gòu)的改變可能造成功能上的差異，實際情況有待進(jìn)一步驗證。

哺乳動物的Lep基因主要在脂肪組織中表達(dá)，不同位置的脂肪組織中表達(dá)情況存在差異，但在肝臟中未檢測到該基因表達(dá)［14］?；|LepA基因主要在肝臟中表達(dá)，在腦、垂體、腎臟、盲腸、胃中表達(dá)量次之，在腸、脾、肌肉、心臟、精巢、頭腎、胸腺中表達(dá)量較低。對虹鱒Oncorhynchus mykiss［15］、黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco［16］、鱖Siniperca chuatsi［17］、條紋鱸Morone saxatilis［13］的研究均表明，Lep主要在肝臟中表達(dá)，而斜帶石斑魚LepA和LepB在肝臟中表達(dá)量較低［17］。此外，斜帶石斑魚LepA和LepB均在腦中大量轉(zhuǎn)錄，鱖腦中Lep表達(dá)也較高，但河豚腦中未檢測到該基因表達(dá)。同時，虹鱒、斜帶石斑魚、黃顙魚的卵巢中也檢測到Lep基因的較高表達(dá)［15-16，18］?；| LepA組織表達(dá)分布差異表明，肝臟為花鱸LepA合成分泌的主要場所。腦是魚類血糖調(diào)控的中樞，能夠調(diào)控機(jī)體的代謝水平，花鱸腦中Lep基因表達(dá)較高，說明Lep基因可能對糖脂代謝供能存在一定的調(diào)控作用。結(jié)合其他研究成果可進(jìn)一步推測，多數(shù)魚類Lep基因主要在肝臟中轉(zhuǎn)錄，但在其他組織中的分布情況存在一定差異，這可能與該基因編碼較低的氨基酸序列高度不保守有關(guān)。Lep結(jié)構(gòu)與組織分布上的差異表明，該基因的功能在物種間可能不同。

本試驗中首次研究了低鹽度對硬骨魚類LepA表達(dá)的影響，低鹽度調(diào)控48 h時，半海水組與淡水組LepA表達(dá)水平顯著低于海水組，表明低鹽度調(diào)控抑制了LepA基因表達(dá)。有研究表明，環(huán)境鹽度的改變對魚類代謝率有顯著影響，為適應(yīng)環(huán)境滲透壓的改變，魚體需消耗大量能量，以提高機(jī)體代謝水平［19］。對蜥蜴Podarcis sicula和羅非魚研究發(fā)現(xiàn)，LepA可動員肝糖原分解，提高血糖水平［20］，進(jìn)而為魚體適應(yīng)滲透壓改變提供能量。由此推測，隨著肝糖原的消耗，魚體代謝所需能量逐漸轉(zhuǎn)為其他代謝方式提供，減弱了LepA對肝糖原分解作用，進(jìn)而降低了LepA的轉(zhuǎn)錄水平。半海水組和淡水組鹽度降低后，花鱸機(jī)體耗能增加，進(jìn)而加速肝糖原分解，促使LepA基因表達(dá)降低。對虹鱒［21］的研究表明，禁食可促進(jìn)Lep轉(zhuǎn)錄，但對鯉［22］研究顯示，長期進(jìn)食對Lep表達(dá)無顯著影響。本試驗中，海水組在前3個采樣時間點中未檢測出顯著差異。虹鱒、大西洋鮭與花鱸Lep氨基酸的一致性分別為25.8%和26.8%，Lep氨基酸序列一級結(jié)構(gòu)的高度不保守，可能是造成物種間LepA差異表達(dá)的重要原因。此外，有研究指出，魚類中存在的兩種Lep亞型，可能有功能上的分化［3］。多種因素可能共同導(dǎo)致不同研究結(jié)果的出現(xiàn)。急性低滲環(huán)境可能抑制花鱸的LepA表達(dá)，魚類間LepA基因在鹽度調(diào)控中的表達(dá)模式存在差異，可能是由于物種間LepA氨基酸序列高度不保守造成。魚類的Lep基因是否參與鹽度調(diào)控還有待在其他魚類中進(jìn)一步研究。

［1］ Zhang Y，Proenca R，Maffei M，et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue［J］.Nature，1994，372：425-432.

［2］ Zhang F，Basinski M B，Beals J M，et al.Crystal structure of the obese protein leptin-E100［J］.Nature，1997，387：206-209.

［3］ Gorissen M，Bernier N J，Nabuurs S B，et al.Two divergent leptin paralogues in zebra fish（Danio rerio）that originate early in teleoste anevolution［J］.Journal of Endocrinology，2009，201：329-339.

［4］ Johnson R M，Johnson T M，Londraville R L.Evidence for leptin expression in fishes［J］.Journal of Experimental Zoology，2000，286：718-724.

［5］ Murashita K，Uji S，Yamamoto T，et al.Production of recombinant leptin and its effects on food intake in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，2008，150：377-384.

［6］ Pelleymounter M A，Cullen M J，Baker M B，et al.Effects of theobese gene product on body weight regulation in ob/ob mice［J］. Science，1995，269：540-543.

［7］ Lee E Y，Park H H，Kim Y T，et al.Cloning and sequence analysis of the interleukin-8 gene from flounder（Paralichthys olivaceous）［J］.Gene，2001，274：237-243.

［8］ Najakshin A M，Mechetina L V，Alabyev B Y，et al.Identification of an IL-8 homolog in lamprey（Lampetra fluviatilis）：early evolutionary divergence of chemokines［J］.European Journal of Immunology，1999，29：375-382.

［9］ Cohen P，Yang G，Yu X X，et al.Induction of leptin receptor expression in the liver by leptin and food deprivation［J］.Journal of Biological Chemistry，2005，280（11）：10034-10039.

［10］ Baltzegar D A，Reading B J，Douros J D，et al.Role for leptin in promoting glucose mobilization during acute hyperosmotic stress in teleost fishes［J］.Journal of Endocrinology，2014，220：61-72.

［11］ 張美昭，高天翔.花鱸親魚人工培育與催產(chǎn)技術(shù)研究［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報，2001，31（2）：195-200.

［12］ 杜濤，黃洋，覃雪迎，等.不同鹽度養(yǎng)殖1齡花鱸（Lateolabrax japonicas）的生長特性差異分析［J］.海洋與湖沼，2013，44 （2）：337-341.

［13］ Eugene T W，David A B，Matthew E P，et al.Cloning and characterization of leptin in a Perciform fish，the striped bass（Morone saxatilis）：control of feeding and regulation by nutritional state ［J］.General and Comparative Endocrinology，2012，178：98-107.

［14］ Secombes C J，Wang T，Hong S，et al.Cytokines and innate immunity of fish［J］.Developmental and Comparative Immunology，2001，25：713-723.

［15］ Laing K J，Zou J J，Wang T H，et al.Identification and analysis of an interleukin 8-like molecule in rainbow trout Oncorhynchus mykiss［J］.Developmental and Comparative Immunology，2002，26：433-444.

［16］ Gong Y，Luo Z，Zhu Q L，et al.Characterization and tissue distribution of leptin，leptin receptor and leptin receptor overlapping transcript genes in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco［J］. General and Comparative Endocrinology，2013，182：1-6.

［17］ He S，Liang X F，Li L，et al.Gene structure and expression of leptin in Chinese perch［J］.General and Comparative Endocrinology，2013，194：183-188.

［18］ Zhang H X，Chen H P，Zhang Y，et al.Molecular cloning，characterization and expression profiles of multiple leptin genes and a leptin receptor gene in orange-spotted grouper（Epinephelus coioides）［J］.General and Comparative Endocrinology，2013，181：295-305.

［19］ Boeuf G，Payan P.How should salinity influence fish growth？-review［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，2001，130c：411-423.

［20］ Paolucci M，Buono S，Sciarrillo R，et al.Effects of leptin administration on the endocrine pancreas and liver in the lizard Podarcis sicula［J］.Journal of Experimental Zoology Part A：Comparative Experimental Biology，2006，305：383-395.

［21］ Kling P，R?nnestad I，Stefansson S O，et al.A homologous salmonid leptin radioimmunoassay indicates elevated plasma leptin levels during fasting of rainbow trout［J］.General and Comparative Endocrinology，2009，162（3）：307-312.

［22］ Huising M O，Geven E J W，Kruiswijk C P，et al.Increased leptin expression in common carp（Cyprinus carpio）after food intake but not after fasting or feeding to satiation［J］.Endocrinology，2006，147：5786-5797.

Cloning and expression analysis of Leptin A gene in seabass Lateolabrax maculatus exposed to low salinity

ZHANG Pei，WEN Hai-shen，CHI Mei-li，QIAN Kun
（College of Fisheries，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

cDNA sequence of Leptin A（LepA）gene，which plays key roles in food intake，growth，reproduction，immunity and energy balance，was cloned by rapid amplification of cDNA ends（RACE）in seabass Lateolabrax maculatus exposed to acute salinity changes：seawater group（a salinity of 32），semi-seawater group（a salinity of 16）and fresh water group（a salinity of 0）.Hepatic LepA mRNA were determined by qPCR 24，48，96，144，and 192 h after salinity exposure.It was found that LepA cDNA was 643 bp in length containing a CDs of 161 amino acid residules，a signal peptide，and four α-helices（A，B，C and D）.Deduced amino acid sequencing showed that the sequence of LepA showed low identity to Leps from other fishes，with conservative three-dimensional structure modeling.LepA was primarily expressed in liver，and a little expression of the LepA was observed in brain. There was significantly less expression of LepA mRNA in seabass in semi-seawater group（accounting for 33.38% of seawater group expression）and fresh water group（accounting for 26.86%of seawater group expression）than that in seawater group at 48 h（P＜0.05），without significant difference between the semi-seawater group and fresh water group（P＞0.05）.LepA mRNA expression was induced to be decreased in all groups after 96 h.The findings suggested that expression of LepA mRNA in seabass be decreased under acute low salinity regulation.

Lateolabrax maculatus；Leptin；salinity；gene clone；gene expression

S917.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.003

2095-1388（2016）01-0013-06

2015-05-12

國家 “十二五”科技支撐計劃重大項目 （2011BAD13B03）

張沛 （1989—），男，碩士研究生。E-mail：pei325@126.com

溫海深 （1963—），男，教授。E-mail：wenhaishen@ouc.edu.cn