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    PCR-RFLP檢測(cè)安慶六白豬BPI基因第10外顯子的多態(tài)性

    2023-07-25 05:20:45陳博赫郭江朱杰文利新譚國(guó)華劉楊馬海明

    陳博赫 郭江 朱杰 文利新 譚國(guó)華 劉楊 馬海明

    摘 ?要:為探討安慶六白豬殺菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein)即BPI基因的遺傳多態(tài)性,本研究通過(guò)PCR-RFLP方法,檢測(cè)了BPI基因第10外顯子在安慶六白豬上的多態(tài)性。結(jié)果表明,在安慶六白豬中,GT基因型為優(yōu)勢(shì)基因型,T等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因;推測(cè)安慶六白豬BPI基因的GT基因型可能具有較高的免疫力,為安慶六白豬的保種和選育提供了有益的資料。

    關(guān)鍵詞:豬;BPI基因;PCR-RFLP

    中圖分類(lèi)號(hào):S813.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A ? ? ? 文章編號(hào):1001-0769(2023)03-0048-02

    殺菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是最早在人多形核中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中被發(fā)現(xiàn)的一種脂多糖結(jié)合蛋白,是中性粒細(xì)胞中的一種蛋白分子,具有抗微生物活性[1]。在動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)和抵抗病毒感染方面,BPI基因不可或缺;BPI基因的多態(tài)性與動(dòng)物機(jī)體免疫力之間存在顯著相關(guān)性。BPI蛋白是一種儲(chǔ)存于中性粒細(xì)胞起抗感染作用的蛋白質(zhì),也被冠以“超級(jí)抗生素”的稱(chēng)號(hào)[2]。安慶六白豬俗名“六花豬”,屬肉脂兼用性地方品種,全身被毛黑色,額部﹑尾端和四肢呈白色,故得“六白”之稱(chēng)。安慶六白豬具有抗病性強(qiáng)、耐粗飼的特性。

    本試驗(yàn)采用PCR-RFLP法,先提取安慶六白豬基因組DNA,用特異性引物擴(kuò)增BPI基因第10外顯子,再選用HpaⅡ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切位點(diǎn)的多態(tài)性,為篩選有效分子標(biāo)記提供基礎(chǔ)依據(jù)。

    1 ?材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

    試驗(yàn)動(dòng)物:214頭安慶六白豬的耳或尾組織。

    主要試劑:瓊脂糖凝膠電泳loading Buffer﹑分子量標(biāo)記、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)、四溴乙烷(tetrabromoethane,TBE)、HpaⅡ限制性?xún)?nèi)切酶、PCR mix、溴化乙錠等。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 基因組DNA提取

    氯化鈉沖洗組織,組織剪碎后加蛋白酶K,經(jīng)1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解液裂解細(xì)胞和消化蛋白質(zhì),用苯酚-氯仿萃取,高速離心后棄上清液,保存DNA。

    1.2.2 PCR-RFLP

    設(shè)計(jì)擴(kuò)增BPI基因第10外顯子的引物序列,上游引物:5'-CCAAACATGGAGATGCAGTTC-3',下游引物:5'-CAATGAATC AATGAGCACACC-3'。以豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系(50 μL)為:PCR Mix 25μL,上下游引物各1.0μL,DNA模板1.0 μL,ddH2O 22.0 μL;PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸5 min, ?4 ℃保存。用限制性核酸內(nèi)切酶HpaⅡ處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,酶切體系(16μL)為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4.0 μL,10×buffer 2.0 μL,HpaⅡ酶 ? 0.5 μL,ddH2O 9.5 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

    2 ?結(jié)果與分析

    2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

    取5 μL PCR產(chǎn)物,用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。產(chǎn)物條帶與預(yù)期大小一致,大小為445 bp。

    2.2 PCR-RFLP分析結(jié)果

    將PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶HpaⅡ進(jìn)行酶切后,產(chǎn)生3種條帶,分別為445 bp、304 bp、142 bp(圖1)。根據(jù)條帶組成確定基因型,分別為GG型(445 bp)、GT型(445 bp、304 bp、142 bp)和TT型(304 bp、142 bp)。

    2.3 安慶六白豬BPI基因的基因型及等位基因頻率

    安慶六白豬BPI基因的基因型及等位基因頻率見(jiàn)表1。結(jié)果表明,安慶六白豬的優(yōu)勢(shì)基因型為GT基因型,優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門(mén)等位基因。

    3 ?結(jié)果與討論

    本研究以214頭安慶六白豬為研究對(duì)象,通過(guò)PCR-RFLP方法,對(duì)BPI基因第10外顯子進(jìn)行了多態(tài)性分析。結(jié)果表明,T是安慶六白豬的優(yōu)勢(shì)等位基因,共存在GG、TT和GT三種基因型,其中GT基因型頻率更高,推測(cè)該基因型的安慶六白豬可能具有較高的免疫應(yīng)答能力。

    參考文獻(xiàn)

    [1] WEISS J,ELSBACH P,OLSSON I,et al.Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes[J].Journal of Biological Chemistry,1978,253(8):2664-2672.

    [2] WIESNER J,VILCINSKAS A.Antimicrobial peptides: the ancient arm of the human immune system[J].Virulence,2010,1(5):440-464.

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