不同分子質(zhì)量區(qū)間的麥胚肽抗過敏活性研究

紀(jì)小國，黃繼紅,2*，楊銘乾，李海月，趙 祎，畢振原

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，河南 鄭州 450000）

不同分子質(zhì)量區(qū)間的麥胚肽抗過敏活性研究

紀(jì)小國1，黃繼紅1,2*，楊銘乾1，李海月1，趙 祎1，畢振原1

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，河南 鄭州 450000）

堿性蛋白酶水解麥胚所獲得的肽類混合物有較高的生物活性。采用超濾法對(duì)麥胚肽進(jìn)行分離，對(duì)不同分子質(zhì)量區(qū)間的小肽進(jìn)行抗過敏活性研究。結(jié)果表明，分離麥胚肽的最佳超濾工藝條件為：操作壓力為0.4 MPa，料液質(zhì)量濃度為 16 mg/mL（10 ku和 5 ku膜）或 20 mg/mL（1 ku膜），周期為1 h；麥胚酶解液經(jīng)全質(zhì)譜鑒定，主要為5 107種不同種類的肽段，建立了簡(jiǎn)易麥胚肽數(shù)據(jù)庫；麥胚肽體外抗過敏活性結(jié)果表明，其抗過敏活性與小肽的分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)，分子質(zhì)量小于1 ku的組分表現(xiàn)出最大的透明質(zhì)酸酶抑制率，達(dá)到82.5%，IC50約為0.87 mg/mL。生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析麥胚肽抗過敏活性位點(diǎn)可能為麥胚肽C端的甘氨酸結(jié)構(gòu)域，通過調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的分化異常和改變靶細(xì)胞細(xì)胞膜通透性來實(shí)現(xiàn)麥胚肽的抗過敏功能。

麥胚肽；超濾法；抗過敏；甘氨酸結(jié)構(gòu)域

0 前言

活性肽是指一類具有特殊生理活性的氨基酸序列，氨基酸數(shù)一般小于20個(gè)，分子質(zhì)量6 000 u以下，而決定其活性的關(guān)鍵是所含氨基酸的種類及其排列順序[1]?；钚噪牡纳砉δ苤饕屑に鼗钚?、調(diào)節(jié)激素功能、神經(jīng)活性、提高免疫力、抗氧化、延緩衰老、抗菌、抗過敏、改善和提高礦物質(zhì)運(yùn)輸、抗腫瘤等[2]。小麥胚芽營養(yǎng)成分復(fù)雜，僅從蛋白質(zhì)角度考慮，除含量豐富的清蛋白和球蛋白外，還有含量較高的醇溶蛋白、谷蛋白和谷胱甘肽等成分。大量研究發(fā)現(xiàn)，采用酶法水解麥胚所獲得的肽類混合物有較高的抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗炎及增強(qiáng)免疫力等功能，具有良好的藥用價(jià)值[3-4]。

目前，國內(nèi)外學(xué)者通過酶解制備麥胚活性肽，并對(duì)其生物活性進(jìn)行了研究，如王才立等[4]研究發(fā)現(xiàn)，麥胚酶解液在降血壓、抗氧化方面具有較高的活性。同時(shí)學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)麥胚肽也具有一定的抗菌和降膽固醇功能，如楊陽[5]采用保溫孵育的方法制備了麥胚抗菌肽，并對(duì)其進(jìn)行了富集和純化；陳雪等[6]優(yōu)化了麥胚降膽固醇肽的酶解工藝等。馬濤等[7]對(duì)多種食源性低聚肽進(jìn)行抗過敏活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥肽的抗過敏活性最高。作者以脫脂麥胚為研究對(duì)象，采用超濾技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行分離富集，研究不同分子質(zhì)量區(qū)間麥胚肽的抗過敏活性及其機(jī)制，為具有抗過敏活性的麥胚肽提供了一個(gè)可工業(yè)化生產(chǎn)的方法，大大拓寬了麥胚資源的綜合利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂麥胚：鄲城財(cái)鑫糖業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（20萬 U/g）：Solarbio公司；透明質(zhì)酸酶（500 U/g）：Sigma公司；透明質(zhì)酸鈉：Solarbio公司；三氟乙酸(TFA)：Fluka 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

723N可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1000紫外分光光度計(jì)：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)型膜分離設(shè)備（雙工位平板膜）：賽普（無錫）膜科技發(fā)展有限公司；LTQ Velos雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀：Thermo Finnigan，San Jose，CA；Zorbax 300SB-C18 peptide traps 柱：Agilent Technologies,Wilmington,DE。

1.3 方法

1.3.1 麥胚肽的制備

參照Diao等[8]的方法利用堿性蛋白酶制備麥胚肽。

1.3.2 麥胚肽的超濾分離

將所制備酶解液依次通過截留分子質(zhì)量為10、5、1 ku的超濾膜進(jìn)行分級(jí)分離，并考察操作壓力、料液質(zhì)量濃度及超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響，確定最佳超濾工藝。

1.3.3 麥胚肽的含量測(cè)定

采用酸溶性肽含量測(cè)定法[9]。

1.3.4 麥胚肽的質(zhì)譜分析

參照He等[10]的方法對(duì)制備的麥胚肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.5 麥胚肽的體外抗過敏活性的測(cè)定

透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)采用Elson-Morgan法[11]，并做適當(dāng)修改。樣品空白對(duì)照組溶液經(jīng)440～700 nm波長范圍掃描，此波長區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)波峰和一個(gè)波谷，在波峰處顯色物質(zhì)的吸光值最大，此時(shí)波長為535 nm。選擇麥胚肽的體外透明質(zhì)酸酶抑制試驗(yàn)的測(cè)定波長為535 nm。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行數(shù)據(jù)的均值，用分析系統(tǒng)軟件SPSS.20和Origin 8.5軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳超濾工藝條件的確定

2.1.1 超濾壓力對(duì)膜通量的影響

以操作壓力為變量，在相同時(shí)間內(nèi)，對(duì)質(zhì)量濃度為20 mg/mL的麥胚酶解液進(jìn)行超濾分離，考察壓力對(duì)超濾膜通量的影響，結(jié)果如圖1所示。在相同壓力條件下，截留分子段為10 ku超濾膜的膜通量最小，并隨著截留分子質(zhì)量的減小而逐漸增大。隨著操作壓力的不斷增大，不同截留分子段的超濾膜的膜通量均出現(xiàn)先快速增大，后增幅放緩的現(xiàn)象。在較小的壓力范圍內(nèi)（＜0.4 MPa），膜通量較小，處于壓力控制階段，幾乎不受膜表面濃差極化現(xiàn)象的影響；而當(dāng)壓力持續(xù)增大（＞0.4 MPa）時(shí)，濃差極化現(xiàn)象顯著，界面濃度差成為影響膜通量的主要因素，處于傳質(zhì)控制區(qū)[12]。在壓力達(dá)到0.4 MPa后，膜表面呈現(xiàn)凝膠層，且隨壓力增大而增厚，持續(xù)加大的壓力將會(huì)與凝膠層阻力相抵，并不能成為增大膜通量的助力。因此選擇0.4 MPa為最適操作壓力。

圖1 操作壓力對(duì)膜通量的影響Fig.1 Effect of operating pressure on membrane flux

2.1.2 料液質(zhì)量濃度對(duì)膜通量的影響

由圖2可知，在0.4 MPa的操作壓力下，將不同質(zhì)量濃度的酶解液超濾分離相同的時(shí)間后，不同截留分子質(zhì)量的超濾膜表現(xiàn)出不一樣的膜通量。截留分子質(zhì)量10 ku的膜的通量依舊最小，且受料液濃度影響較大；而截留分子質(zhì)量1 ku的超濾膜則與之相反。對(duì)于截留分子質(zhì)量為10 ku和5 ku的超濾膜，選擇16 mg/mL為最佳濃度；而對(duì)于1 ku的截留膜，選擇20 mg/mL為最適的膜分離濃度。

圖2 料液質(zhì)量濃度對(duì)膜通量的影響Fig.2 Effect of feed mass concentration on membrane flux

2.1.3 超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響

由圖3可知，在0.4 MPa的操作壓力下，將質(zhì)量濃度20 mg/mL的麥胚酶解液依次通過10、5、1 ku的超濾膜，進(jìn)行不同時(shí)間的超濾分離，發(fā)現(xiàn)超濾時(shí)間是影響超濾膜通量的重要因素。如圖3所示，截留分子質(zhì)量分別在10、5、1 ku的超濾膜膜通量均在1 h后趨于穩(wěn)定。為提高超濾效率，選擇1 h為一個(gè)運(yùn)行周期。

圖3 超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響Fig.3 Effect on ultra-filtration time on membrane flux

2.2 麥胚肽的分布情況

圖4為麥胚酶解液經(jīng)過不同截留分子段的超濾膜后各截留分子段中麥胚肽的含量。通過1 ku超濾膜的組分中肽含量最高，截留分子段大于10 ku、5～10 ku和1～5 ku組分的肽含量較為接近，均處于較低水平。取蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的平均相對(duì)分子質(zhì)量為120 u，則透過10 ku和5 ku的超濾膜的組分的平均肽鏈長度在42個(gè)氨基酸以上，以多肽為主；而截留分子質(zhì)量在5 ku以下的組分肽鏈相對(duì)較短，以相對(duì)分子質(zhì)量小于1 ku（平均鏈長在8個(gè)氨基酸以下）短肽和游離氨基酸為主，約占72%。由此可見，短肽和游離氨基酸為堿性蛋白酶水解麥胚蛋白后的主要成分。

圖4 麥胚酶解液中不同分子質(zhì)量肽段的含量分布Fig.4 The distribution of peptides with different molecular weight in enzymatic hydrolysate of wheat germ

2.3 麥胚肽的質(zhì)譜分析

脫脂麥胚經(jīng)堿性蛋白酶水解后的多肽混合物通過LC-MS/MS分析，得到麥胚酶解液的總離子流色譜圖（圖5）。根據(jù)質(zhì)荷比和保留時(shí)間繪制而成，用來反映樣品的色譜分離度、肽段信號(hào)強(qiáng)度、樣品小肽構(gòu)成的復(fù)雜程度等信息。不同時(shí)間洗脫的峰較多，相對(duì)豐度較高，說明麥胚肽樣品肽段種類豐富，復(fù)雜程度高。

圖5 麥胚酶解液的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatogram of enzymatic hydrolysate of wheat germ

通過質(zhì)譜結(jié)合Uniport數(shù)據(jù)庫，建立了麥胚肽的簡(jiǎn)易數(shù)據(jù)庫，包括5 107種不同種類的小肽及其氨基酸序列、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等信息，為生物活性肽的篩選和構(gòu)效關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)。分子段1 ku以下的麥胚肽236種、1～5 ku的小肽3 802種、5～10 ku的麥胚肽95種、10 ku以上的974種。其中1～5 ku分子段的麥胚肽種類最為豐富，根據(jù)小肽的氨基酸組成分析，1 ku以下的麥胚肽中特有的甘氨酸結(jié)構(gòu)域，可能會(huì)影響其抗過敏活性。如Kim等[13]從病人的血清中分離出了具有富含甘氨酸的抗過敏活性肽段 LVAHVGAGGVL、RVSSCRGRNHIV、GFWCRRSGLVGV，可以顯著地抑制抗原刺激的肥大細(xì)胞的組胺釋放，同時(shí)也可以降低大鼠嗜堿性粒細(xì)胞β-己糖胺酶的釋放，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣離子的升高。

表1 堿性蛋白酶酶解的麥胚肽的分子段分布Table 1 Molecule weight distribution of wheat germ peptides of alkaline protease enzymolysis

2.4 麥胚肽抗過敏活性結(jié)果分析

如圖6a顯示，在相同濃度條件下，隨著分子質(zhì)量的減小，麥胚肽的透明質(zhì)酸酶體外抑制活性呈增高趨勢(shì)，其中分子段小于1 ku的組分的抑制率明顯高于其他兩組分，抑制率達(dá)到82.5%。對(duì)于不同濃度的麥胚肽組分，分子質(zhì)量在1～5 ku和5～10 ku時(shí)，其抗過敏活性隨濃度的變化不明顯，且在較高濃度時(shí)的抗過敏活性僅為18%和9%。以上結(jié)果顯示，分子質(zhì)量小于1 ku的麥胚肽的抗過敏活性較高，其抗過敏活性和分子質(zhì)量大小、分子段內(nèi)的小肽種類有密切關(guān)系。

圖7為分子段小于1 ku的麥胚肽的抗過敏活性與其濃度間的量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度小于0.8 mg/mL時(shí)，抗過敏活性隨其濃度的升高而快速增加；隨著濃度持續(xù)增大，活性的上升趨勢(shì)有所下降，并在1.2 mg/mL時(shí)逐漸趨于平穩(wěn)，此時(shí)透明質(zhì)酸體外抑制率達(dá)81.09%。SAS分析顯示該分子質(zhì)量段的 IC50為（0.87±0.14）mg/mL，說明分子質(zhì)量小于1 ku的麥胚肽具有較強(qiáng)的抗過敏活性。另外，將圖7中數(shù)值進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，得到回歸方程：y=-28.404 02x2+98.058 04x-1.982 14；R2=0.986 04。相關(guān)系數(shù)R為0.993 0，方程可信度較高，能夠較好地解釋小分子麥胚肽（＜1 ku）抗過敏性的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖6 麥胚肽超濾組分的體外透明質(zhì)酸酶抑制活性Fig.6 The hyaluroniuse inhibition rate of ultrafiltration components of wheat germ peptides in vitro

圖7 麥胚肽超濾組分（＜1 ku）的體外透明質(zhì)酸酶抑制活性Fig.7 The hyaluroniuse inhibition rate of ultrafiltration components of wheat germ peptides（＜1 ku）in vitro

生物分子的活性與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，對(duì)一種大分子物質(zhì)進(jìn)行功能性研究，確定其分子結(jié)構(gòu)并利用分子的結(jié)構(gòu)特征與相應(yīng)生物活性之間的關(guān)系，找出結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性之間的定量關(guān)系來預(yù)測(cè)新化合物的活性已逐漸成為活性肽研究的主流。

根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，對(duì)分子質(zhì)量小于1 ku的麥胚肽進(jìn)行檢索，得到具有富含甘氨酸結(jié)構(gòu)域的典型肽段的信息如表2所示?？梢钥闯觯∮? ku的麥胚肽的末端（C端）氨基酸多為甘氨酸，其序列中富有甘氨酸?？梢婝溑唠牡目惯^敏活性和其富含的甘氨酸結(jié)構(gòu)域及末端氨基酸密切相關(guān)。對(duì)麥胚肽的抗過敏的活性有如下解釋：（1）Gly分子質(zhì)量小,不具有側(cè)鏈,小肽中的高含量Gly，尤其是一對(duì)Gly的存在能夠增強(qiáng)肽鏈的彈性、形成多變的空間結(jié)構(gòu)對(duì)其抗過敏活性可能有重要的作用。（2）富含Gly的小肽通常帶有凈的正電荷,這使得它們能影響抗體蛋白和靶細(xì)胞的細(xì)胞膜的相互作用，使其細(xì)胞膜和抗體蛋白的結(jié)合力降低，從而減輕過敏反應(yīng)的癥狀。如分子質(zhì)量在20 ku左右的動(dòng)物源性攻擊素，在溶液中呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。攻擊素通過與脂多糖的相互作用，抑制外膜蛋白質(zhì)的合成，影響細(xì)胞膜和IgE蛋白的結(jié)合[14]。（3）植物中典型活性肽富含甘氨酸的重復(fù)域、β-折疊以及形式靈活的螺旋結(jié)構(gòu)，富含甘氨酸的重復(fù)域能夠使得小肽具有很高的靈活性，并且在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用時(shí)形成扣式結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域周圍伴隨著 Try、His、Arg、Asn 和 Glu，影響活性肽的疏水性。植物中富含甘氨酸的蛋白質(zhì)或多肽是植物的防御及修復(fù)系統(tǒng)的主要作用因子，對(duì)于動(dòng)物的免疫系統(tǒng)有類似的效果。分子段小于1 ku的麥胚肽結(jié)構(gòu)信息表明，可能通過特殊的甘氨酸結(jié)構(gòu)域改變靶細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性和修復(fù)免疫系統(tǒng)異常來影響其抗過敏活性。

表2 可能具有抗過敏活性的典型肽段信息Table 2 The information of peptides with ant-allergic activity

過敏反應(yīng)主要通過抗原（致病源）進(jìn)入機(jī)體后與附著在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的 IgE分子結(jié)合，并觸發(fā)該細(xì)胞釋放生物活性物質(zhì)，引起臨床表現(xiàn)和病理變化[15-17]。過敏反應(yīng)有兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn):（1）麥胚肽可能通過特有的甘氨酸扣式結(jié)構(gòu)域?qū)C(jī)體的免疫系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的分化異常。（2）麥胚肽特有的結(jié)構(gòu)可能通過影響肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性，降低IgE分子的結(jié)合效率，減少活性物質(zhì)的釋放，降低機(jī)體的過敏反應(yīng)。麥胚肽的抗過敏作用呈現(xiàn)出多層次、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，可能在調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的分化異常、抑制免疫球蛋白 IgE產(chǎn)生、改變靶細(xì)胞膜通透性等多個(gè)環(huán)節(jié)中起作用，具體的作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與展望

以脫脂麥胚為原料進(jìn)行麥胚肽制備，在超濾分離富集的基礎(chǔ)上分析了不同分子段的抗過敏活性和劑量關(guān)系，探討其抗過敏活性機(jī)制，得出如下結(jié)論：（1）超濾工藝對(duì)麥胚肽具有較好的分離富集效果，麥胚肽的主要成分為短肽,分子質(zhì)量小于1 ku的組分表現(xiàn)出最大的透明質(zhì)酸酶抑制率，并具有一定的劑量相關(guān)性；（2）建立包含5 107種肽段的麥胚肽的簡(jiǎn)易數(shù)據(jù)庫，選取具有典型結(jié)構(gòu)的麥胚肽，分析得出麥胚肽抗過敏活性和甘氨酸結(jié)構(gòu)域有關(guān)。

超濾技術(shù)分離富集得到的麥胚肽表現(xiàn)較強(qiáng)的抗過敏活性，但是分離機(jī)制主要依靠分子排阻技術(shù)，而該分離手段還不足以達(dá)到預(yù)期的效果，麥胚肽活性的大小與其分子質(zhì)量、氨基酸組成、首末端氨基酸、二級(jí)結(jié)構(gòu)等關(guān)系密切；后續(xù)的研究準(zhǔn)備利用具有高度的專一性、選擇性的分子印跡技術(shù)作為新型的分離手段，得到單一的肽段進(jìn)一步分析。本文是依據(jù)前期課題組優(yōu)化的堿性蛋白酶酶解麥胚肽的基礎(chǔ)[8]，用質(zhì)譜解析了可能存在的抗過敏肽，有必要繼續(xù)對(duì)這些肽段進(jìn)行逐一抗過敏活性研究。麥胚活性肽的制備及性質(zhì)研究可以有效提高麥胚資源的綜合利用率，為高生物活性肽的制備提供了新方法，同時(shí)也可為功能性保健品及藥品原料的開發(fā)提供借鑒。

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ANTI-ALLERGIC ACTIVITY OF WHEAT GERM PEPTIDES WITH DIFFERENT MOLECULAR WEIGHT RANGE

JI Xiaoguo1， HUANG Jihong1，2， YANG Mingqian1， LI Haiyue1， ZHAO Yi1， BI Zhengyuan1
（1.School of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.Food Industry Research Institute of Henan Province，Zhengzhou 450000，China）

Active peptide is a kind of amino acid sequence with special physiological activity，of which the number of amino acids is generally less than 20，molecular weight of 6 000 u or less，and the key factor determine its activity is the type of amino acids and their arrangement.The peptide mixture obtained by alkalineprotease hydrolysis of wheat germ has high biological activity.The wheat germ peptides were separated and enriched by ultra-filtration method in this study，and the anti-allergic activity and structure-function relationship of these peptides fragments were analyzed.The result showed that the optimized ultra-filtration conditions of separating the wheat germ peptides were as follows:time of 1 h，pressure of 0.4 MPa，temperature of 25℃ and the filtrate concentration of 16 mg/mL （10 ku and 5 ku）or 20 mg/mL （1 ku）.After ultra-filtration，the constituents were identified by mass spectrometry，which revealed that 5 170 kinds of different peptide fragments were included accounting for more than 72%.Meanwhile，the simple database of the peptides of wheat germ was set up.The result of the anti-allergic activity demonstrated that the ant-allergic activity of these peptides fragments had negative correlation with the molecular weight.These fragments with molecular weight less than 1 ku had the highest inhibition ratio of 82.5%，while the IC50was 0.87 mg/mL.C-terminal glycine structural domain of small peptide was proved to be the active site of anti-anaphylaxis by bioinformatics techniques combined with mass spectrometry analysis.The anti-anaphylaxis of wheat germ peptides was realized by regulating of the prosoplasia of the Th2 cell and changing the membrane permeability of target cell.This study will not only provide a considerable measure to separate wheat germ peptides for food industry but also supply the reference for the development of functional health food and pharmaceutical raw materials.

wheat germ peptides；ultra-filtration；anti-anaphylaxis；structural domain of glycine

TS201；TQ464.7

B

1673-2383(2017)03-0031-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.012.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-6-21 10:50:32

2016-09-03

河南工業(yè)大學(xué)谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（001254）；河南省國際科技合作與交流項(xiàng)目（152102410032）；鄭州市國際科技合作與交流項(xiàng)目（141PGJHZ546）

紀(jì)小國（1993—），男，河南周口人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。

*通信作者