4種方法提取花臉香蘑胞內(nèi)多糖及其理化性質(zhì)比較研究

王蘭英，唐 萌，徐盼菊，楊海茹，黃燕怡，曾 俊

（吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519000）

4種方法提取花臉香蘑胞內(nèi)多糖及其理化性質(zhì)比較研究

王蘭英，唐 萌，徐盼菊，楊海茹，黃燕怡，曾 俊

（吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519000）

以花臉香蘑為材料，采用熱水浸提法、復(fù)合酶提法、堿液提取法、超聲提取法提取花臉香蘑多糖，并對(duì)獲得的粗多糖的多種理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析，確定了花臉香蘑多糖的最佳提取方法。結(jié)果表明：不同的提取方法對(duì)多糖得率及成分均有重要影響，其中堿提多糖得率最高，為（21.10±0.13）%，超聲提取多糖得率最低，為（8.15±0.17）%；4種方法提取的粗多糖溶液其紅外圖譜特征峰相似，但略有不同，結(jié)合在1 022～1 153 cm-1區(qū)域內(nèi)的吸收峰，堿提多糖的糖環(huán)結(jié)構(gòu)可能為呋喃型，其他3種粗多糖可能為吡喃型；熱水浸提法、復(fù)合酶法、超聲提取法提取的多糖溶液對(duì)DPPH均有較高的清除率，而堿提多糖溶液對(duì)DPPH自由基清除率較低，僅為6%～7%；4種方法提取的多糖溶液對(duì)羥基的清除率相差不大且均隨糖濃度的上升而增大，達(dá)到最大值100%。結(jié)合提取效果及多糖的生物活性，復(fù)合酶法提取的粗多糖得率高、純度高，具有極強(qiáng)的抗氧化活性，為最佳提取方法。

花臉香蘑；提取工藝；抗氧化；多糖；傅里葉紅外光譜儀

0 前言

多糖是一種重要的生物活性化合物，廣泛存在于自然界中。糖類分子不但擔(dān)負(fù)著能源和結(jié)構(gòu)支架的職能,而且還擔(dān)負(fù)著攜帶細(xì)胞信息的職能[1]。對(duì)糖類的研究，從最初的糖的結(jié)構(gòu)、化學(xué)合成、代謝途徑等逐漸發(fā)展到糖蛋白、糖脂等糖復(fù)合物等方面。真菌多糖作為多糖類物質(zhì)的重要來源，具有多種生理活性如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗突變、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化、抗輻射和抗?jié)兊裙π2]。自1988年起我國(guó)已成為食用菌生產(chǎn)第一大國(guó)，其產(chǎn)值僅次于糧、棉、油、果、菜，居第6位，成為我國(guó)重要的園藝產(chǎn)業(yè)及創(chuàng)匯產(chǎn)業(yè)[3]。隨著人們生活水平的提高，食用菌在食品領(lǐng)域的價(jià)值獲得極大提高，一系列多種多樣的食用菌相關(guān)新型食品相繼面市。

花臉香蘑營(yíng)養(yǎng)豐富，具有多糖、二萜類等多種活性成分，據(jù)報(bào)道花臉香蘑多糖具有抗菌、保肝、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、抑制水稻細(xì)條病的病原菌、提高免疫力等功效[4-12]。真菌多糖由于提取方法不同，其多糖的得率及理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生相應(yīng)地變化，通過比較花臉香蘑4種不同提取方法的試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)獲得的多糖的理化性質(zhì)選取最佳提取方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株由吉林大學(xué)珠海學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑與儀器

纖維素酶：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；果膠酶、木瓜蛋白酶：上海源葉生物有限公司；濃硫酸、乙醇、葡萄糖、鄰苯三酚、水楊酸、鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2450紫外可見分光光度計(jì)、IRPrestige-21傅里葉紅外光譜儀：日本島津；TP-520H電子天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司。

1.3 液體發(fā)酵

按蔗糖3%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、酵母粉1%的配方配制7 L培養(yǎng)基，于25℃、150 r/min發(fā)酵罐中培養(yǎng)7 d，收集菌絲體，洗凈后冷凍干燥，過50目篩備用。

1.4 多糖提取方法

1.4.1 熱水浸提法

稱取1 g菌絲體粉末，按照料液比1∶60(g/mL)加水，90℃提取2 h，提取完畢后抽濾。收集清液，減壓濃縮至1/10體積，用3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉，靜置于4℃冰箱24 h，8 000 r/min離心15 min，收集沉淀用無水乙醇反復(fù)洗滌，于40℃烘箱烘干，記錄其質(zhì)量。

1.4.2 堿液提取法

配制0.5 mol/L NaOH溶液，稱取1 g菌粉，按照料液比 1∶60(g/mL)加堿液，90 ℃提取 2 h，抽濾。收集清液，濃縮至1/10體積，用3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉，靜置于4℃冰箱24 h，8 000 r/min離心15 min，收集沉淀用無水乙醇反復(fù)洗滌，于40℃烘箱烘干，記錄其質(zhì)量。

1.4.3 復(fù)合酶提取法

稱取1 g菌粉，加入0.6%的復(fù)合酶（W纖維素酶∶W果膠酶∶W木瓜蛋白酶=6∶1∶8），按料液比 1∶60(g/mL)加水，用0.5 mol/L NaOH和HCl調(diào)pH至7，40℃、120 r/min恒溫水浴酶解2 h后，沸水浴滅酶活性10 min，抽濾。收集清液，濃縮至1/10體積，用3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉，置于4℃冰箱24 h，8 000 r/min離心15 min，沉淀用無水乙醇洗滌，于40℃烘箱烘干，記錄其質(zhì)量。

1.4.4 超聲輔助提取法

稱取1 g菌粉，按料液比1∶60(g/mL)加水超聲輔助提取120 min，功率300 W，頻率40 kHz。抽濾，收集清液，濃縮至1/10體積，用3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉，靜置于4℃冰箱24 h，8 000 r/min離心15 min，收集沉淀用無水乙醇反復(fù)洗滌，于40℃烘箱烘干，記錄其質(zhì)量。

1.5 花臉香蘑的多糖理化性質(zhì)測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法測(cè)定粗多糖中的多糖含量[13]；用考馬斯亮藍(lán)-G250法測(cè)定粗多糖中的蛋白質(zhì)含量[14]。將4種方法提取的粗多糖進(jìn)行紫外圖譜掃描，分別配制0.1 mg/mL的多糖溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，觀察其在260、280 nm波長(zhǎng)處有無吸收峰；取1 mg左右干燥多糖樣品，加入適量KBr粉末研磨混勻后，壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.6 抗氧化活性測(cè)定

1.6.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

[15]略加改動(dòng),配制多個(gè)濃度梯度樣品溶液，在試管中依次加入1.5 mL樣品液，1.5 mL 0.1 mmol DPPH的95%乙醇溶液,混勻后避光反應(yīng)30 min，在 517 nm測(cè)吸光度值（A）。

式中：A0為對(duì)照組吸光度值，1.5 mL蒸餾水加1.5 mL DPPH溶液；Ai為樣品組吸光度值，1.5 mL樣品溶液加1.5 mL DPPH溶液；Aj為空白組吸光度值，1.5 mL樣品溶液加上1.5 mL 95%乙醇。

1.6.2 羥基自由基清除率測(cè)定[16]

配制多個(gè)濃度梯度的樣品溶液，加入9 mmol/L FeSO4溶液 1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加8.8 mmol/L H2O2溶液l mL啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃水浴反應(yīng)0.5 h后，每組3個(gè)平行，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。

式中：A0為對(duì)照組吸光度值，1 mL蒸餾水加1 mL FeSO4、1 mL 水楊酸-乙醇溶液、1 mL H2O2溶液；Ai為樣品組吸光度值，1 mL樣品溶液加1 mL FeSO4、1 mL水楊酸-乙醇溶液、1 mL H2O2溶液；Aj為空白組吸光度值，1 mL樣品溶液加上2 mL蒸餾水、1 mL 95%乙醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖得率、含量及蛋白質(zhì)含量比較

如表1所示，4種提取方法中，堿液提取法的多糖得率最高，達(dá)到了（21.10±0.13）%，超聲波輔助提取法的多糖得率最低，為（8.15±0.17）%，熱水浸提法與復(fù)合酶法的多糖得率分別為（11.94±0.20）%和（19.61±0.60）%；熱水浸提法及復(fù)合酶法提取的粗多糖中糖含量較高，分別達(dá)到了（91.03±1.20）%和（94.47±3.84）%，而超聲輔助提取法獲得的粗多糖中多糖含量最低，為（67.75±2.24）%；4種方法提取多糖蛋白質(zhì)含量均較低。從上述分析可以看出，堿液提取法與復(fù)合酶提取法粗多糖得率要遠(yuǎn)高于其他兩種方法，而復(fù)合酶法的多糖含量比堿液法高19.54個(gè)百分點(diǎn)，說明復(fù)合酶法獲得的多糖產(chǎn)量大、純度高，為4種方法中的最佳提取方法。堿液提取法的多糖得率是4種提取方法中最高的，同時(shí)蛋白質(zhì)含量最低，但粗多糖中多糖純度不高，且獲得的粗多糖較黏稠，不易干燥。熱水浸提法獲得的多糖得率較低，但粗多糖的多糖含量較高，蛋白質(zhì)含量為（3.12±0.30）%，說明熱水浸提法獲得的粗多糖產(chǎn)量少，但純度較高，該方法需長(zhǎng)時(shí)間在較高溫度下進(jìn)行，故能耗較高；超聲輔助提取法的多糖得率最低，同時(shí)粗多糖中多糖含量也最低，蛋白質(zhì)含量為（2.31±0.14）%，說明超聲輔助提取法獲得的多糖產(chǎn)量低、純度低，提取效果不 甚理想。

表1 4種方法提取多糖得率、含量和蛋白含量比較Table 1 Comparison of polysaccharides yield and content and protein content with four extraction methods %

2.2 紫外分析

將熱水浸提法（A）、堿液提取法（B）、復(fù)合酶法（C）、超聲輔助法（D）提取的多糖水溶液在 200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，由圖1可知A、C、D在200 nm均附近有糖的特征吸收，而A、B、C在260、280 nm附近有吸收，說明A、B、C中可能含有核酸以及蛋白質(zhì)。

圖1 4種方法提取的多糖的紫外光譜Fig.1 UV spectrum of polysaccharides extracted by four methods

2.3 紅外圖譜分析[17-18]

由圖2可知，4種方法提取的多糖在3 400 cm-1處附近均有吸收峰，可能是由糖分子內(nèi)或分子間的O—H伸縮振動(dòng)引起的，2 900 cm-1處為飽和C—H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，1 600 cm-1處為C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 400 cm-1處附近特征峰為C—H變角振動(dòng)。A、C、D提取的多糖在1 022～1 153 cm-1區(qū)域內(nèi)有吸收峰，表明此3種多糖中的糖環(huán)構(gòu)型可能為吡喃型，而B提取的多糖的糖環(huán)結(jié)構(gòu)可能為呋喃型。B、C、D 分別在 866 cm-1、925 cm-1、856 cm-1處有特征吸收，說明其糖苷鍵可能為β型糖苷鍵，而A在此區(qū)域無明顯吸收峰，無法判斷其糖苷鍵類型。

2.4 抗氧化活性比較

2.4.1 DPPH自由基清除

由圖3可知，3種多糖溶液均有較高的清除率，其中，復(fù)合酶法提取的糖溶液在0.01～1 mg/mL區(qū)域內(nèi)清除率上升速度很快，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，清除率為91.29%，其后清除率穩(wěn)定在91%左右，說明復(fù)合酶法提取的多糖在低濃度區(qū)域即對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力，且在4種方法中，復(fù)合酶法提取的多糖溶液清除率最高，達(dá)到了91.62%；超聲提取的糖溶液在低質(zhì)量濃度區(qū)域0.01～1 mg/mL清除率上升速度較快，在4種方法中僅次于復(fù)合酶法，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率為76.93%，其后上升緩慢，趨于穩(wěn)定，最終在8 mg/mL時(shí)，清除率為85.73%；熱水提取的多糖溶液在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率為21.22%，在質(zhì)量濃度1～6 mg/mL區(qū)域保持平穩(wěn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到6 mg/mL時(shí)，清除率趨于穩(wěn)定，最大清除率為80.56%。在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)由堿液提取的多糖溶液于0.25～0.5 mg/mL時(shí)反應(yīng)出現(xiàn)了與其他3種多糖溶液不同顏色變化，在多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除率為13.32%，隨后基本在小范圍內(nèi)波動(dòng)，清除率在6%～7%之間，猜測(cè)在反應(yīng)過程中有新的物質(zhì)產(chǎn)生。

圖2 4種方法提取的多糖的紅外光譜Fig.2 Infrared spectrogram of polysaccharides extracted by four methods

圖3 4種方法提取的多糖溶液對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH free radicals scavenging ability of polysaccharides extracted by four methods

2.4.2 羥基自由基清除

如圖4所示，4種方法提取的多糖溶液對(duì)羥基自由基的清除率上升趨勢(shì)基本一致，上升速度略有不同。在0.01～1 mg/mL的低質(zhì)量濃度區(qū)域，堿液提取法獲得的多糖溶液清除率上升速度最慢，說明低濃度的堿液提取的多糖溶液對(duì)羥基自由基的清除率最低，在1 mg/mL時(shí)為18.29%；熱水浸提法與復(fù)合酶法提取的多糖溶液在0.01～1 mg/mL區(qū)間，清除率上升趨勢(shì)相似，熱提法多糖溶液清除率略高于復(fù)合酶法，在1 mg/mL時(shí)，熱水浸提法和復(fù)合酶法提取的多糖溶液對(duì)羥基的清除率分別為40.79%和33.75%；超聲提取的多糖溶液在0.01～1 mg/mL的區(qū)間，清除率上升最快，在1 mg/mL時(shí)為51.64%，說明低質(zhì)量濃度的超提多糖溶液即對(duì)羥基自由基有較強(qiáng)的清除效果。在多糖溶液質(zhì)量濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，堿液提取法與超聲輔助提取法所獲得的多糖清除率均已達(dá)到穩(wěn)定，約為100%；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到6 mg/mL，熱水浸提法與復(fù)合酶法所獲得的多糖溶液清除率趨于穩(wěn)定，約為100%。

圖4 4種方法提取的多糖溶液對(duì)羥基自由基的清除率Fig.4 Hydroxy free radicals scavenging ability of polysaccharides extracted by four methods

3 結(jié)論

根據(jù)此前的文獻(xiàn)報(bào)道，花臉香蘑多糖的提取方法較為單一，多采用熱水浸提的方法，而其他提取方法未見系統(tǒng)的報(bào)道。通過對(duì)熱水浸提法、復(fù)合酶提取法、堿液提取法、超聲輔助提取法所提取的花臉香蘑多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)比較，可以選取花臉香蘑多糖的最佳提取方法。

試驗(yàn)結(jié)果顯示：熱水浸提法提取多糖純度高，操作簡(jiǎn)單，但得率較低，耗能高；堿液提取法擁有操作簡(jiǎn)便、多糖產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，但提取獲得的多糖含量較低、純度不高，且對(duì)設(shè)備的耐腐蝕性要求較高，能耗大；復(fù)合酶提取法提取多糖得率高、含量高、純度高，能耗少，但需用酶酶解，提高了提取成本；超聲輔助提取法得率為（8.15±0.17）%，相較于其他方法最低，多糖含量為（67.75±2.24）%，說明純度不高，提取效果不佳，但其操作簡(jiǎn)單，可在室溫條件下進(jìn)行，能耗低。

上述4種方法提取花臉香蘑各有優(yōu)點(diǎn)，研究者可根據(jù)目的、試驗(yàn)條件的不同選擇相應(yīng)的方法。但從多糖提取綜合效果看，復(fù)合酶法提取的粗多糖得率為（19.61±0.60）%，多糖含量最高，為（94.47±3.84）%，蛋白質(zhì)含量較低，對(duì)DPPH自由基以及羥基自由基均有較高的清除率，為最佳提取方法。

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COMPARISON OF EXTRACTION METHODS AND PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF POLYSACCHARIDES FROM LEPISTA SORDIDA

WANG Lanying，TANG Meng， XU Panju， YANG Hairu， HUANG Yanyi， ZENG Jun
（Zhuhai College of Jilin University， Zhuhai 519000，China）

Polysaccharide is one kind of the most important bioactive compounds，which are widely distributed in nature，and take on the function of energy and structure and cell information.In this study，four kinds of extraction methods such as hot water，alkaline solution，multiplex-enzyme and ultrasonic-assisted were used to extract polysaccharides from Lepista sordida.The effects of different extraction methods on the physicochemical properties of the polysaccharide were compared and analyzed by ultraviolet spectrometry，infrared spectroscopy and other methods.The optimum extraction method of polysaccharides from Lepista sordida was selected.The results showed that the extraction method had significant effect on the yield and composition of polysaccharides.The highest yield of polysaccharides（21.10±0.13）%was afforded by alkali extraction，while the lowest yield（8.15+0.17）%was afforded by ultrasonic extraction method.The infrared spectrum characteristic peaks of the four polysaccharides were similar.According to the peaks among 1 022～1 153 cm-1，the ring structure of polysaccharides extracted in alkaline solution probably was furanose ring，and the other three was pyranose ring.The polysaccharide solutions extracted by hot water，multiplex-enzyme and ultrasonic-assisted all had a high DPPH radicals scavenging ability，but poor effect was afforded using polysaccharide extracted in alkaline solution.The polysaccharides extracted by the four methods all had excellent scavenging ability on hydroxy radicals，and the scavenging rates were increased with the increasing of concentration until to the maximum of 100%.Little difference occurred in hydroxy radicals scavenging rate of polysaccharides extracted by the four methods.Combination of the extraction yield and bioactivity of the products，multiplex-enzyme was the optimum extraction method，and the afforded polysaccharides had better extraction efficiency and purity，lower protein content and the best anti-oxidant activity.

Lepista sordida；extraction process；anti-oxidation；polysaccharide；infrared spectroscopy

TS201.2

B

2016-09-29

廣東省教育廳青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2016KQNCX208）

王蘭英（1982—），女，山東煙臺(tái)人，博士，講師，主要從事藥食用真菌活性物質(zhì)研究與開發(fā)。

1673-2383(2017)03-0061-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.022.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-6-21 10:50:49