長白山地區(qū)龍膽生產(chǎn)品質(zhì)影響因素探究

武靖涵，左 柏，張?zhí)熘?

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117；2.吉林省北藥藥材加工有限公司，長春 130000）

龍膽為龍膽科植物龍膽Gentiana scabra Bge.、條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、三花龍膽Gentiana triflora Pall.或堅(jiān)龍膽Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根莖[1]。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦，性寒，歸肝、膽經(jīng)，有清熱燥濕、瀉肝膽火的作用[2]。除堅(jiān)龍膽外，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、河北及東北三省地區(qū)。

近年來，由于中藥用量大幅度增加，促使飲片生產(chǎn)逐漸由小規(guī)模作坊式轉(zhuǎn)向現(xiàn)代化、工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，且隨著《中華人民共和國中醫(yī)藥法》的實(shí)施和中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目的設(shè)立，飲片標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的重要性也逐漸顯現(xiàn)[3-6]。龍膽作為常用大宗藥材，飲片生產(chǎn)過程較為簡單，主要有“選、洗、潤、切、干”五道工序。在前期已得出龍膽在實(shí)際工業(yè)中最佳生產(chǎn)方法的基礎(chǔ)上，本研究選擇不同產(chǎn)地、不同等級的龍膽藥材，以龍膽苦苷和水溶性浸出物的含量為指標(biāo)，探究飲片生產(chǎn)過程中對其質(zhì)量產(chǎn)生影響的因素，為龍膽從藥材到飲片的生產(chǎn)過程中的質(zhì)量傳遞提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 龍膽苦苷對照品（批號：110770-201013）購于中國藥品生物制品檢定所，甲醇為分析純（北京化工廠）、色譜純（Fisher Chemical）；水為超純水。龍膽藥材由吉林北藥藥材加工公司提供，基源由各產(chǎn)地工作人員鑒定龍膽藥材來源，見表1。

1.2 儀器 PM1 000 高效液相色譜儀（日立儀器有限公司），BT25S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），PTX-FA110S 萬分之一電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司），YM-100S 超聲波清洗機(jī)（深圳市語盟超聲波清洗劑設(shè)備廠），Medium-s300 實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

炮制機(jī)械設(shè)備來自吉林省北藥藥材加工有限公司藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）車間，主要有篩選機(jī)（型號：SX-2，富陽亳州康華制藥機(jī)械有限公司）、振動篩（型號：XZS-2，天津市渤海鑫茂制藥設(shè)備有限公司）、變頻風(fēng)選機(jī)（型號：FX-1，天津市渤海鑫茂制藥設(shè)備有限公司）、熱風(fēng)循環(huán)烘箱（型號：CT-C-I，南京飛翔干燥制冷設(shè)備廠）、直線往復(fù)式切藥機(jī)（型號：WFQY-300，天津市渤海鑫茂制藥設(shè)備有限公司）。

表1 龍膽藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 龍膽苦苷含量測定方法

2.1.1 色譜條件 PM-1 000 日立高效液相色譜儀；色譜柱Agilent XDB-C18 柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相為甲醇（A）:水（B），洗脫程序?yàn)椋?～20 min，20%A，20～80 min，25%～75%A，80～90 min，100%A，90～100 min，20%A；流速為0.8 mL/min；柱溫為35℃；檢測波長為243 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取一定量龍膽苦苷對照品置于20 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度為1.201 mg/mL 的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取批次1 龍膽適量，粉碎，過四號篩，取約0.5 g，精密稱定，置20 mL 容量瓶中，加50%甲醇約18 mL，超聲（功率250 W，頻率20 kHz）30 min，取出，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關(guān)系 取“2.1.2”對照品溶液，分別進(jìn)樣4、8、12、16、20、24 μL，測定峰面積。以進(jìn)樣體積、峰面積為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=1,413,755,967.65X-57,438.07，r=1.00，在4.802～28.812 μg 范圍內(nèi)，龍膽苦苷線性良好。

2.1.5 重復(fù)性 在批次1 中平行取6 份樣品，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，按“2.1.1”條件依次進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算龍膽苦苷含量。測定結(jié)果為：龍膽苦苷含量平均為4.788%，RSD 為：0.09%，方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性 取批次1 樣品適量制備供試品溶液，室溫下放置，在0、4、8、12、16、20、24 h 按“2.1.1”方法分別測定，記錄峰面積。龍膽苦苷色譜峰面積RSD 為0.51%，供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 精密度 取批次1 同一供試品溶液，按“2.1.1”條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。龍膽苦苷色譜峰面積RSD 為0.23%，儀器精密度良好。

2.1.8 加樣回收率 取批次1 龍膽粉末樣品（已知成分含量）6 份，約0.5 g，精密稱定，加入龍膽苦苷對照品適量，按“2.1.3”方法制備加樣供試品溶液，按“2.1.1”條件測定，記錄峰面積，計(jì)算含量及回收率。結(jié)果龍膽苦苷回收率為99.93%，RSD 為1.09%。回收率在95.0%～105.0%之間，RSD 均小于3.0%，該方法回收率較好。

2.1.9 樣品測定 稱取龍膽樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下操作制備龍膽供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，見圖1 和圖2。各樣品龍膽苦苷及水溶性浸出物含量，見表2。各批次龍膽中龍膽苦苷含量均符合《中國藥典》2015 版標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 龍膽藥材指紋圖譜的建立 取12 批龍膽藥材粉末，按“2.1.2” “2.1.3”方法制備對照品溶液和供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件依次測定，得到色譜圖（圖1、圖2）。將12 批次龍膽樣品的色譜圖導(dǎo)入2004 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件，進(jìn)行多點(diǎn)校正及自動匹配，以S1 為參照圖譜，選用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度0.1 min，得到對照圖譜R，12 批次龍膽藥材指紋圖譜，見圖3。經(jīng)過匹配，確認(rèn)13 個(gè)共有色譜峰，再與對照品色譜圖相比較，確認(rèn)13 個(gè)共有特征峰中，5 號峰為龍膽苦苷。以5 號峰龍膽苦苷為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間及其RSD，并應(yīng)用軟件計(jì)算相似度。計(jì)算結(jié)果為，各共有峰保留時(shí)間的RSD分別為0.33%、0.39%、0.20%、0.38%、0.00%、0.25%、0.31%、0.14%、0.15%、0.19%、0.19%、0.16%、0.14%，相似度均大于0.9。指紋圖譜結(jié)果表明各批次龍膽樣品質(zhì)量較穩(wěn)定，無明顯差異。

圖1 混合對照品 HPLC 圖譜

圖2 龍膽樣品S1 HPLC 圖譜

圖3 12 批龍膽藥材指紋圖譜

2.3 水溶性浸出物測定 按照水溶性浸出物測定法（《中國藥典》2015 版第四部通則2201）項(xiàng)下的熱浸法測定，結(jié)果見表2。

2.4 生產(chǎn)過程樣品測定 龍膽飲片生產(chǎn)過程可分為如下工序：揀選、水洗、潤制、切制和干燥。依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室正交試驗(yàn)及實(shí)際生產(chǎn)驗(yàn)證，龍膽實(shí)際生產(chǎn)過程為龍膽藥材經(jīng)篩選及人工揀選后，快速“搶水洗”，悶潤2 h，切段，自然晾干。對品質(zhì)產(chǎn)生影響的因素主要為水洗、潤制和干燥三個(gè)環(huán)節(jié)。為在同一條件下比較樣品質(zhì)量，規(guī)定“搶水洗”時(shí)長統(tǒng)一為60 s。樣品制備過程，見圖4，各批次樣品測定結(jié)果，見表2。

各批次樣品中龍膽苦苷與水溶性浸出物含量變化趨勢見圖5 和圖6[7]。由折線圖及文獻(xiàn)得出，龍膽苦苷含量經(jīng)“搶水洗”后，非藥用部位、雜質(zhì)被除去，龍膽苦苷實(shí)際含量未變但相對含量升高；經(jīng)潤制后龍膽苦苷含量增減不定，是由于潤制過程中龍膽苦苷溶于水后水留存或流失導(dǎo)致；經(jīng)干燥后龍膽苦苷含量明顯增加[8-11]。龍膽經(jīng)水洗后水溶性浸出物明顯減少，表明水洗工序帶走部分浸出物，所以在完成洗凈的前提下應(yīng)盡量縮短水洗時(shí)間；潤藥后，浸出物少量增加，推測由于龍膽內(nèi)水溶性裂環(huán)烯醚萜苷類成分繼續(xù)溶出；干燥后浸出物明顯增加。

圖4 樣品制備過程

表2 各樣品龍膽苦苷及水溶性浸出物含量 %

圖5 1～6 批次樣品含量變化

圖6 7～12 批次樣品含量變化

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)在藥典基礎(chǔ)上，對檢測波長、洗脫程序及龍膽樣品的提取方法和溶劑進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，其他條件相同情況下，檢測波長243 nm 得到的譜圖相對于270 nm 得到的譜圖色譜峰數(shù)量更多，峰形更好，可增加指紋圖譜中的共有峰數(shù)量，使評價(jià)更全面。流動相在《中國藥典》甲醇—水（25:75）的基礎(chǔ)上，根據(jù)出峰時(shí)間、分離度、峰形等進(jìn)行調(diào)節(jié)，最終確定洗脫程序?yàn)?～20 min，20%A，20～80 min，25%～75%A，80～90 min，100%A，90～100 min，20%A，使各峰之間分離分析效果較好，利于計(jì)算。提取方法方面分別考察加熱回流15 min、超聲提?。üβ?50 W，頻率20 kHz）30、45、60 min，比較3 個(gè)成分的含量，結(jié)果較為相近，由于超聲提取法簡單易行，故選擇超聲提取30 min。提取溶劑考察100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇，其余條件相同情況下，結(jié)果顯示50%甲醇提取效果較好且節(jié)約成本，故選擇提取溶劑為50%甲醇[12-14]。

龍膽生產(chǎn)過程中，已廣泛使用炮制機(jī)械[15]。揀選一步，單獨(dú)使用篩選機(jī)或風(fēng)選機(jī)等炮制機(jī)械，揀選效果不佳，殘留雜質(zhì)較多，雖然采用人工效果較好，但是會導(dǎo)致時(shí)間和人工成本大幅度增加，所以實(shí)際生產(chǎn)中一般采用先篩選或風(fēng)選，出去部分雜質(zhì)，再進(jìn)行人工揀選，除去根部細(xì)小雜質(zhì)或多余須根、殘莖。水洗一步，一般無明確時(shí)間要求，但由于龍膽苦苷等成分溶于水，所以水洗時(shí)間應(yīng)盡量減少，最短時(shí)間內(nèi)洗凈泥沙及多余雜質(zhì)，稱“撈洗”或“搶水洗”。潤藥一步，由于龍膽整體體積較小，水洗后表面留存水量較少，潤藥過程中易蒸發(fā)，實(shí)際生產(chǎn)中一般采用悶潤，即在潤藥容器表面加蓋一層隔水隔熱材料，減少水分散失，使悶潤更充分[16]。切制一步，雖然有設(shè)定長度，但是由于原料藥材在傳動帶上的擺放位置、前進(jìn)速度及往復(fù)式切藥機(jī)刀口升降頻率、機(jī)器精度等問題，并不能做到切制后的飲片長度精確一致，一般在±3 mm 范圍內(nèi)浮動，依據(jù)《中國藥典》2015 版第四部炮制通則中關(guān)于切制短段長度為5～10 mm 的規(guī)定，可設(shè)定儀器切制長度為7 mm[17-18]。切制工序經(jīng)過查找文獻(xiàn)、進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)和咨詢飲片生產(chǎn)車間技術(shù)人員后，視為對龍膽質(zhì)量不產(chǎn)生影響[7]。干燥一步，《中國藥典》2015版規(guī)定龍膽飲片水分不得超過9.0%，應(yīng)隨時(shí)關(guān)注、控制樣品中水分，不超過藥典標(biāo)準(zhǔn)且不過度干燥[19-20]。

綜上所述，在龍膽飲片生產(chǎn)過程中，以龍膽苦苷和水溶性浸出物為主要指標(biāo)，龍膽品質(zhì)受干燥因素影響較大，具體原因尚不明確，有待進(jìn)一步探究。本研究在已完成龍膽飲片炮制生產(chǎn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上完成，對實(shí)際生產(chǎn)中把握生產(chǎn)進(jìn)程、控制產(chǎn)品質(zhì)量有一定實(shí)際應(yīng)用意義，也可為其他炮制方法相似的藥材提供實(shí)際生產(chǎn)方面的參考。