茵陳蒿湯對非酒精性脂肪性肝病大鼠細(xì)胞色素氧化酶P450-2E1 影響研究

譚 婷，何 棟，朱紅梅，何宜榮，艾碧琛

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長沙 410000）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是獲得性代謝應(yīng)激相關(guān)的肝臟疾病，指除卻飲酒過量，包括其他原因形成肝損傷所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積過多。NAFLD 的發(fā)生發(fā)展與家族遺傳、生存環(huán)境、體內(nèi)代謝，以及生活方式等諸多因素有關(guān)。NAFLD 的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，公認(rèn)的是“二次打擊”學(xué)說[1]。相關(guān)研究證實(shí)，細(xì)胞色素氧化酶 P450-2E1（CYP2E1）參與了NAFLD二次打擊學(xué)說脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程。本研究采用改良化高脂飲食建立NAFLD 大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以茵陳蒿湯治療NAFLD 大鼠，通過觀察NAFLD 大鼠中CYP2E1 的表達(dá)，探討茵陳蒿湯在NAFLD 中的治療機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與實(shí)驗(yàn)飼料 實(shí)驗(yàn)動物：50 只SPF 級雄性SD 大鼠[湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：43004700030748，許可證號：SYXK（湘）2016-0002]，體質(zhì)量：（200±20）g。實(shí)驗(yàn)飼料：普通飼料（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司提供），高脂飼料的組成為：基礎(chǔ)飼料88%＋膽固醇2%＋豬油10%[2]。并且前期實(shí)驗(yàn)已造模成功[3]。

1.2 藥物 茵陳蒿湯的組成及劑量：茵陳18 g，梔子12 g，大黃6 g（依據(jù)高等中醫(yī)藥學(xué)十二五規(guī)劃的《方劑學(xué)》教材70 kg 成人臨床劑量）。中藥來源：芝林藥業(yè)（長沙金榮譽(yù)峰）。中藥制作：將所有藥材加入蒸餾水浸泡0.5 h后，煎煮30 min，冷卻后，用紗布過濾，用藥量依據(jù)人與動物用藥劑量的體表面積換算法進(jìn)行計(jì)算[4]，配制成1.28 g/mL 濃度的藥液。辛伐他汀來源：山東鑫齊藥業(yè)有限公司，批號：20170508。同法將辛伐他汀的藥物濃度配備成0.2 mg/L，并把所有藥物保存在4 ℃冰箱備用。

1.3 主要儀器及試劑 實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國Bio-Rad CFX Connect），CYP2E1 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（promega A3500），Real-time PCR mix（Promega A6000），Trizo1 試劑盒（Invitrogen），引物由上海生工公司合成。

2 方法

2.1 造模分組和給藥 50 只雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)法將大鼠分為空白對照組（n=15）和實(shí)驗(yàn)組（n=35）。實(shí)驗(yàn)動物房自然采光，相對濕度為30%～60%，溫度保持在25 ℃左右，實(shí)驗(yàn)組大鼠予以造模，進(jìn)行高脂飼料投喂，空白對照組大鼠用普通飼料投喂，自由取食飲水，喂養(yǎng)至第24 周末時(shí)，從2 組中各隨機(jī)選取5 只大鼠，腹主動脈采血并處死，取出大鼠肝臟，病理切片，檢測其是否成功造模。成功后，將實(shí)驗(yàn)組30 只大鼠隨機(jī)分成3 組，每組10 只，分別是茵陳蒿湯組、SVT 組大鼠以及非酒精性脂肪肝組。喂養(yǎng)大鼠的過程，每周記錄實(shí)驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量，觀察其體型、精神狀態(tài)及死亡情況。實(shí)驗(yàn)各組在成功造模后，每組大鼠按照1 mL/200 g 進(jìn)行灌胃，給予對應(yīng)的藥物灌胃6 周。每天也用等容積的蒸餾水給非酒精性脂肪肝組和空白對照組灌胃1 次。

2.2 制備標(biāo)本 6 周后，末次藥物灌胃，提前禁食12 h，記錄實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量，麻醉后進(jìn)行腹主動脈采血，取出大鼠肝臟，沖洗氯化鈉溶液后，稱肝濕質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)。取肝右葉組織，切除一部分固定在10% 甲醛液中，剩余的部分保存在液氮內(nèi)，放在-80 ℃冰箱里保存?zhèn)溆?。全部血液?biāo)本保存在4 ℃環(huán)境下，2 h后在4 ℃下以2 000 r/min 離心10 min，完成后，取出血清，保存在-80 ℃冰箱中備用。

2.3 觀察及指標(biāo)檢測方法 1）觀察和稱量計(jì)算觀察肝臟形態(tài)，以及稱量肝濕質(zhì)量和計(jì)算肝指數(shù)（%）。肝指數(shù)（%）=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；2）采用全自動生化分析儀檢測血清TC、TG、LDL-c；3）肝組織HE 染色且于光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化；4）使用PCR檢測肝組織CYP2E1 基因表達(dá)：取肝組織，按Trizol試劑盒提供的方法提取RNA，利用Real-time PCR 儀自帶軟件MJ Opticon Monitor Analysis Software（Version 3.1） 收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。見表1。

表1 β-actin、CYP2E1 引物信息

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計(jì)量資料，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 基本情況 空白對照組的大鼠體型正常，毛色亮，神態(tài)佳，活動靈敏，飲食正常；非酒精性脂肪肝組的大鼠體型肥胖，毛色晦暗，精神及飲食不佳，活動靈敏度差。2 組大鼠均未死亡。

3.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 空白對照組肝細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)均勻，大小一致，肝板肝竇清晰可見；非酒精性脂肪肝組中央靜脈周圍肝細(xì)胞肥大，胞質(zhì)中可見空泡樣變性，并有脂肪細(xì)胞浸潤其中，中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增生，內(nèi)皮下有脂質(zhì)沉積，可見炎性浸潤及肝細(xì)胞壞死；SVT 組脂肪細(xì)胞消失，門管區(qū)周圍肝細(xì)胞殘存少量空泡樣變，肝竇內(nèi)可見膽汁淤積，少許炎性浸潤；但茵陳蒿湯組肝細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)中空泡變性消失，無脂肪空泡，內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積，肝細(xì)胞壞死和炎性浸潤顯現(xiàn)不明顯。見圖1。

圖1 各大鼠肝組織病理變化（HE 染色，×100）

3.3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠CYP2E1 相對表達(dá)量比較 見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠CYP2E1 相對表達(dá)量比較（，n =10）

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠CYP2E1 相對表達(dá)量比較（，n =10）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05；與非酒精性脂肪肝組比較，△P ＜0.05；與SVT 組比較，▲P ＜0.05

3.4 各組實(shí)驗(yàn)大鼠LDL-c、TC、TG 含量比較 見表3。

3.5 各組體質(zhì)量及肝質(zhì)量的比較 見表4。

表3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠LDL-c、TC、TG 含量比較（，n =10） mmol/L

表3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠LDL-c、TC、TG 含量比較（，n =10） mmol/L

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05；與非酒精性脂肪肝組比較，△P ＜0.05；與SVT 組比較，▲P ＜0.05

表4 各組實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)比較（，n =10）

表4 各組實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)比較（，n =10）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05；與非酒精性脂肪肝組比較，△P ＜0.05；與SVT 組比較，▲P ＜0.05

4 討論

NAFLD 是一種代謝應(yīng)激性肝損傷，與遺傳、胰島素抵抗（IR）等密切相關(guān)[5]?！岸未驌簟睂W(xué)說作為現(xiàn)階段NAFLD 公認(rèn)的理論。第一次打擊學(xué)說是指由于IR 引起的脂質(zhì)積聚，致脂肪變性，引發(fā)肝臟損傷調(diào)節(jié)修復(fù)，在此基礎(chǔ)上導(dǎo)致了第二次打擊，第二次打擊學(xué)說是指脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙以及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)炎癥、纖維化，甚至壞死[6-7]。細(xì)胞色素氧化酶P450 是一類酶，是肝臟代謝主要的酶系之一，在內(nèi)源性和外源性化合物中參與代謝，存在多種同工酶，CYP2E1 作為主要的一種，大部分分布于肝臟，在“二次打擊”學(xué)說中，CYP2E1的誘導(dǎo)表達(dá)可加重肝內(nèi)脂質(zhì)代謝異常，且參與肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡、炎性因子形成以及星狀細(xì)胞活化等過程，是參與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化的關(guān)鍵酶[8]。KATHIRVEL 等[9]實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)：CYP2E1 過度表達(dá)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，糖原儲備減少，并促進(jìn)葡萄糖合成，增加脂肪堆積，減少肝臟中的胰島素信號傳導(dǎo)，增強(qiáng)胰島素抵抗，并加重肝臟損害[10]。本研究結(jié)果亦表明，NAFLD 模型大鼠中肝組織中的CYP2E1 的表達(dá)增加，與對照組比較有顯著差異，表明CYP2E1 參與了脂質(zhì)過氧化及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與了NAFLD 的形成。

非酒精性脂肪性肝病在中醫(yī)學(xué)中并無專用對應(yīng)病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，把此病歸為“肝癖”的范疇，其主要是由于外感濕邪，飲食不節(jié)，或臟腑虧損等諸多原因而發(fā)病，導(dǎo)致體內(nèi)津液輸布功能異常，聚濕生痰，久致肝郁脾虛，痰濕瘀積使血行不暢，漸至肝積[11]。茵陳蒿湯在《金匱要略·黃疸病脈證并治》篇中曰：“谷疸之為病，寒熱不食，食即頭眩，心胸不安，久久發(fā)黃為谷疸，茵陳蒿湯主之。”茵陳蒿湯由茵陳蒿、梔子、大黃組成，具有清熱利濕退黃的功效，方中茵陳蒿清熱祛濕退黃，梔子清熱瀉火，通利三焦，使?jié)駸嶂皬男”愣?；大黃通利大便，使?jié)駸嶂皬拇蟊愣拢T藥配伍加強(qiáng)瀉濁之功。研究[12]證實(shí)茵陳蒿湯在治療非酒精性脂肪性肝病能取得滿意療效。現(xiàn)代藥理研究[13]發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿湯諸藥合用具有改善血脂，抗氧化能力，降低組織炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞，從而治療NAFLD。本研究結(jié)果顯示，與非酒精性脂肪肝組比較，茵陳蒿湯組能夠明顯降低NAFLD 大鼠TC、TG、LDL-c 以及CYP2E1 的表達(dá)水平，前期實(shí)驗(yàn)[3]結(jié)果中顯示，從肝組織的病理變化中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過治療后，在茵陳蒿湯組中，只存在少量脂肪空泡，病變組織顯著減輕，肝細(xì)胞壞死和炎性浸潤顯現(xiàn)不明顯。

綜上所述，茵陳蒿湯能夠減輕脂質(zhì)異常代謝，降低組織炎癥反應(yīng)，改善肝功能，保護(hù)肝組織，對于治療非酒精性脂肪性肝病有確切的臨床療效，且此實(shí)驗(yàn)為治療NAFLD 提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。