生大黃粉治療新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎實驗研究

賈艷萍，謝秀春，賈毛毛，馬丹陽，羅世杰，馮愛民*

（陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）為新生兒期一種嚴重的胃腸道疾病，是導致新生兒腸穿孔及全身炎癥反應綜合征（systemin inflammatory response,SIRS）的主要原因之一[1]，也是導致新生兒死亡的重要病因[2]。

隨著早產(chǎn)兒存活率的不斷提高，NEC 發(fā)病率明顯增加，在低出生體質(zhì)量兒中約為2.50%，在極低出生體質(zhì)量兒中約為4.53%[3]，病死率高達15%～30%[4]，尚無特效防治手段。NEC 確切的病因及發(fā)病機制尚不明確，目前研究認為，NEC 的發(fā)生主要由于多種致病因素綜合作用于發(fā)育尚不成熟的胃腸道，使腸黏膜局部缺血，腸道蠕動功能減弱，食物在腸腔內(nèi)滯留，致胃腸功能紊亂，使致病菌繁殖，引起腸道炎癥反應，激發(fā)炎癥風暴。如腸壁缺血/缺氧及再灌注損傷[5-6]、早產(chǎn)[7-8]及低出生體質(zhì)量[9]、感染及炎癥反應[10-11]、喂養(yǎng)不當[12]等綜合影響下導致NEC 的發(fā)生。在上述各致病因素的作用下，NEC 引起腸道功能障礙，造成腸道內(nèi)中性粒細胞浸潤、黏膜下水腫、出血，消化道絨毛結(jié)構(gòu)破壞，甚至穿孔或壞死等病理改變，發(fā)生敗血癥、感染性休克等嚴重并發(fā)癥[13]。因此NEC 的恰當治療對提高生存率，改善預后至關(guān)重要。

現(xiàn)代藥理研究證實，大黃具有保肝利膽[14]、抑制多種菌種[15]、瀉下、活血、止血、調(diào)節(jié)血脂[16]、保護腸道黏膜屏障、降低腸道細菌移位率[17]等作用。本課題對生大黃粉治療新生鼠NEC 的效果進行了研究，同時，通過對腸組織勻漿胃動素（MTL）和促胃液素（GAS）含量的測定，探討其治療機制，以期為臨床應用生大黃粉治療新生兒NEC 提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 早產(chǎn)兒配方奶粉（特別能恩）由雀巢公司提供；湯臣倍健蛋白粉購自湯臣倍健股份有限公司；脂肪乳注射液（C14-C24）由華瑞制藥有限公司提供；脂多糖（LPS）購自北京Solarbio 公司；CY-12C 型便攜式數(shù)字測氧儀；大鼠GAS ELISA 檢測試劑盒（批號：YX-O72000R）、大鼠MTL ELISA 檢測試劑盒（批號：YX-132012R）；醫(yī)用純氮氣：純度≥99.9%，由陜西中醫(yī)藥大學實驗中心提供；醫(yī)用純氧氣：由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制氧站提供；生大黃粉購自陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室，生大黃粉液配制方法：大、中、小劑量組分別取2.04、1.02、0.51 g 生大黃粉，分別直接加入15 mL 熱水中，0.1 mL 生大黃粉液中含生大黃劑量分別為0.013 6 g，0.006 8 g，0.003 4 g。

1.2 動物與分組 SPF 級新生2 d 齡SD 大鼠72 只，生產(chǎn)許可證：SCXK（川）2015-030，購自成都達碩實驗動物有限公司。將體質(zhì)量5～12 g 新生大鼠采用隨機數(shù)字表法分為6 組，每組12 只。A 組僅接受人工喂養(yǎng)；B 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復氧冷刺激+LPS+生理鹽水；C 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復氧冷刺激+LPS+西咪替??；D 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復氧冷刺激+LPS+大劑量生大黃；E 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復氧冷刺激+LPS+中劑量生大黃；F 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復氧冷刺激+LPS+小劑量生大黃。

1.3 方法

1.3.1 人工喂養(yǎng) 新生SD 大鼠在出生后48 h 置于保育箱內(nèi)（溫度28～30 ℃，濕度45%～65%），采用代乳品人工喂養(yǎng)，代乳品配制見表1，每100 mL 代乳品添加早產(chǎn)兒奶粉6.0 g，蛋白粉10.7 g，脂肪乳48.9 mL，總熱量約7020 kJ，采用6 號灌胃針定時經(jīng)口插管喂養(yǎng)，第1 天給予0.2 mL/6 h，隨后每24 h 增加0.1 mL，48 h 后逐漸增至0.4 mL。

表1 人工喂養(yǎng)代乳品配方與鼠乳主要成分的比較

1.3.2 缺氧、復氧及冷刺激 CY-12C 型測氧儀調(diào)零后，將探頭連接至缺氧箱出口處，入口處充入氮氣，打開氮氣罐流量表，控制氮氣流量為15 L/min，當缺氧箱氧濃度為零時迅速將除A 組外余60 只新生鼠置入，90 s 后關(guān)閉氮氣閥，打開缺氧箱，取出新生鼠，隨后將其置入含100%氧氣的復氧箱中，10 min 后將新生鼠置于4 ℃冰箱冷藏，持續(xù)10 min 后放回保育箱，每日2 次，連續(xù)3 d。

1.3.3 LPS 腹腔注射LPS 0.1 mL（10 mg/kg），每日1 次，連續(xù)3 d。

1.3.4 藥物治療 B 組灌胃生理鹽水0.1 mL，C 組灌胃西咪替丁0.1 mL（相當于0.000 34 mg），D 組每次灌胃生大黃粉液0.1 mL（含生大黃13.6 mg），E 組每次灌胃生大黃粉液0.1 mL（含生大黃6.8 mg），F(xiàn) 組每次灌胃生大黃粉液0.1 mL（含生大黃3.4 mg），均間隔8 h 給藥1 次，連續(xù)3 d。

1.3.5 組織病理評分標準 所有動物于第4 天空腹頸椎脫臼處死，取回盲部近端腸組織上下各1 cm 立即固定，脫水，石蠟包埋，切片及HE 染色，參照文獻[18]評分標準進行雙盲腸組織病理評分：0 分為腸絨毛及上皮完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1 分為輕度黏膜下和（或）固有層腫脹分離；2 分為中度黏膜下和（或）固有層腫脹分離，黏膜下和（或）肌肉層水腫；3 分為重度黏膜下和（或）固有層腫脹分離，黏膜下和（或）肌肉層水腫，局部絨毛脫落；4 分為腸絨毛消失和（或）伴腸壞死；組織評分≥2 分，確定為NEC。

1.3.6 腸組織GAS、MTL 含量檢測 將剩余腸組織置于冰生理鹽水中漂洗、濾紙拭干稱重，冰浴下制作10%腸組織勻漿，4 ℃低溫離心，3 500 r/min，離心15 min，取上清液分裝于EP 管中，置于-80℃冰箱中待測，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組新生鼠MTL、GAS 含量。

1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析，治療前后各組之間采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊者用LSD 比較，方差不齊者用Tamhane′s 比較，等級資料用Kruskal-Wallis H 檢驗；以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及體質(zhì)量變化

2.1.1 一般情況 B 組、C 組、D 組、E 組、F 組在造模后新生鼠均出現(xiàn)活動減少，倦怠，反應遲鈍，喂養(yǎng)困難、吐奶及胃潴留，腹部脹滿，進而可見大便顏色性狀發(fā)生改變，均不同程度排黃綠便或黑色稀便。除A組外，余各組在缺氧過程中新生鼠均出現(xiàn)煩躁、抽搐、呼吸困難、紫紺、大小便失禁。復氧后新生鼠逐漸恢復自主活動，膚色轉(zhuǎn)紅，其中D 組、E 組、F 組復氧需幾十秒至1 min 不等，B 組、C 組復氧約需3 min；冷刺激10 min 后，新生鼠出現(xiàn)全身皮膚冰冷，黏膜蒼白，立即置于保育箱保暖，D 組、E 組、F 組膚色不足1 min 恢復，B 組、C 組約2～3 min 膚色恢復。A 組活動度可，納乳及排便正常，無腹脹及腹瀉。

2.1.2 各組實驗前后NEC 動物體質(zhì)量比較 各組新生鼠實驗前體質(zhì)量、實驗后體質(zhì)量，見表2。經(jīng)單因素方差分析（ANOVA），實驗前A 組、B 組、C 組、D組、E 組、F 組新生鼠體質(zhì)量相似（P＞0.05）。實驗結(jié)束后，根據(jù)LSD 多重比較進一步推斷，各組間體質(zhì)量比較：A 組＞E 組＞D 組＞F 組＞C 組，B 組與C組體質(zhì)量無差異。結(jié)果表明，生大黃（粉）及西咪替丁對NEC 大鼠體質(zhì)量增長有改善作用，且前者優(yōu)于后者，見表2。

表2 各組實驗前后NEC 動物體質(zhì)量及其差值比較（，n =12） g

表2 各組實驗前后NEC 動物體質(zhì)量及其差值比較（，n =12） g

注：與其他各組比較，# P ＜0.05

2.2 新生鼠腸組織HE 染色病理學改變 用HE 染色法記錄新生鼠腸組織回盲部形態(tài)變化，光鏡下可觀察到D 組、E 組、F 組腸絨毛生長旺盛，結(jié)構(gòu)相對整齊，部分輕度水腫，黏膜下層和固有層輕度分離，分離程度較B 組、C 組明顯減輕（圖1-D、圖1-E、圖1-F）；B 組、C 組新生鼠腸組織損傷嚴重，黏膜下層和固有層腫脹分離明顯，腸絨毛水腫，黏膜下層及固有層可見嗜酸性粒細胞、中性粒細胞浸潤（圖1-B、圖1-C）；A 組腸組織結(jié)構(gòu)完整清晰，黏膜層、黏膜下層及固有層未見明顯分離，且無炎癥細胞浸潤（圖1-A）。

圖1 NEC 模型治療后各組新生鼠腸組織（HE，×100）

2.3 不同干預方式對NEC 動物模型病理評分的比較 新生鼠腸組織病理評分結(jié)果，見表3。由于腸組織病理評分為等級資料，不符合正態(tài)分布，采用Kruskal-Wallis H 檢驗后，P＜0.05，故各組間病理評分存在顯著差異；D 組、E 組、F 組之間比較結(jié)果顯示，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 不同干預方式對NEC 動物模型病理評分的比較（，n =12）

表3 不同干預方式對NEC 動物模型病理評分的比較（，n =12）

注：與B 組比較，# P ＜0.05

2.4 各組腸組織勻漿中MTL、GAS 含量比較 各組新生鼠腸組織MTL、GAS 含量見表4，各組間MTL含量比較：A 組＞D 組＞C 組＞B 組，A 組＞E組＞C 組＞B 組，A 組＞F 組＞C 組＞B 組，D 組、E 組及F 組之間MTL 含量相似，差異無統(tǒng)計學意義，說明缺氧等腸損傷后，腸組織內(nèi)MTL 表達降低，經(jīng)生大黃粉治療后，可使腸組織中MTL 升高；各組間GAS 含量比較：B 組＞C 組＞D 組＞A 組，B 組＞C組＞E 組＞A 組，B 組＞C 組＞F 組＞A 組，D 組、E 組及F 組之間GAS 含量相似，差異無統(tǒng)計學意義，說明缺氧等腸損傷后，腸組織內(nèi)GAS 表達升高，經(jīng)生大黃粉治療后，可使腸組織中GAS 表達降低。

表4 各組腸組織勻漿中MTL、GAS 含量比較（，n =12） pg/mL

表4 各組腸組織勻漿中MTL、GAS 含量比較（，n =12） pg/mL

注：與B 組比較，# P ＜0.05

3 討論

中醫(yī)學中并沒有特定的“壞死性小腸結(jié)腸炎”病名，根據(jù)患者表現(xiàn)出的“腹脹、便秘、嘔吐”等癥狀，當屬中醫(yī)“痞滿”“便秘”“嘔吐”“呃逆”等范疇，其病位在脾、胃、大腸、小腸等。壞死性小腸結(jié)腸炎的病因尚不明確，多認為與初生兒、胎怯兒先天稟賦不足，臟腑嬌嫩，形氣未充有關(guān)。壞死性小腸結(jié)腸炎的根本病機是氣機逆亂、脾胃功能失調(diào)。NEC 的內(nèi)科治療以禁食、胃腸減壓、胃腸外營養(yǎng)、有效抗菌藥物抗感染、液體復蘇、輔助通氣等對癥支持治療為主[19-20]，外科主要通過手術(shù)治療。在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上，生大黃粉對NEC 有非常顯著的防治作用[21]，其作用機制與抑制NF-κB P65 蛋白表達相關(guān)，大黃上清液可抑制Caco-2 炎癥細胞Toll 樣受體的表達，減輕炎癥反應。

生大黃性味苦寒，入脾、胃、肝、大腸、心包經(jīng)；能下瘀血、通血閉；推陳致新，破癥瘕積聚，除留飲宿食；攻積導滯，宣通氣機；調(diào)暢脾胃氣機，具有瀉下作用；生大黃調(diào)暢脾胃氣機的作用與壞死性小腸結(jié)腸炎氣機逆亂，脾胃功能失調(diào)相契合。諸多研究證實，生大黃對胃腸道調(diào)節(jié)作用明顯。研究表明，大黃具有減輕氧自由基損害，抑制腸道炎癥反應[22]，促進平滑肌收縮，保護消化道黏膜，增加胃動力，促進止血等作用[23]。

MTL 和GAS 是對胃腸功能有重要調(diào)節(jié)作用的激素。MTL 作用于消化系平滑肌上的胃動素受體，導致平滑肌收縮加強，加速胃排空和縮短食物在小腸內(nèi)的停留時間，起著“清道夫”的作用[24-25]。GAS 是由胃竇及十二指腸和空腸上段黏膜中G 細胞分泌的一種胃腸激素，其主要生理作用是刺激胃腸道的分泌，使胃酸、胃蛋白酶分泌增加，促進胃粘膜血流量增加、胃平滑肌收縮[26-27]。它能促進胃的運動，也能增強幽門括約肌的收縮，其總效應是延緩胃排空。本實驗結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，生大黃治療組MTL 升高、GAS 降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與西咪替丁組比較，生大黃治療組中MTL 表達高于西咪替丁組，GAS 表達低于西咪替丁組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；生大黃各劑量組之間比較，MTL、GAS表達相似，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。HE染色結(jié)果顯示，生大黃治療組腸絨毛結(jié)構(gòu)相對整齊，部分輕度水腫，黏膜下層和固有層輕度分離，生理鹽水組、西咪替丁組腸組織損傷嚴重，黏膜下層和固有層腫脹分離明顯，腸絨毛水腫，黏膜下層及固有層可見嗜酸性粒細胞、中性粒細胞浸潤；生大黃治療組其病理評分均值低于生理鹽水組及西咪替丁組，且相同實驗因素下其發(fā)病率明顯減低。

綜上所述，生大黃粉能夠降低新生鼠NEC 模型腸損傷程度，且效果優(yōu)于西咪替丁，提示生大黃粉有可能成為防治NEC 的一種有效藥物。本實驗結(jié)果提示不同劑量生大黃對腸損傷病理切片改善無明顯差異，且生大黃作為單味中藥，目前對其吸收代謝、作用機制、藥物效果的研究還不全面，特別是在治療NEC 方面僅處于探索階段，還需要大量研究奠定基礎(chǔ)。