咪唑立賓結(jié)晶工藝研究

程曜峰，冷 鳳，孫丙林，張 煒*，張雪霞*

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015； 2.華北制藥集團(tuán)華勝有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050015)

咪唑立賓(Mizoribine，MZR)，商品名為布累迪寧，是1971年從真菌Eupenicilliumbrefedianum的培養(yǎng)液中分離得到的一種咪唑類(lèi)核苷[1]，其分子式為C9H13N3O6，化學(xué)名為5-羥基-1-β-D-呋喃糖基-1H咪唑-4-羧酸胺，呈白色或微帶黃色的結(jié)晶粉末[2]。咪唑立賓早期作為抗真菌藥物開(kāi)發(fā)，后期研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫抑制效應(yīng)和抗腫瘤作用[3]。咪唑立賓作為兼抗腫瘤和抗排斥雙重特性的免疫抑制劑，臨床多應(yīng)用于腎移植術(shù)后患者的治療，在降低排斥反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)，預(yù)防、治療腎移植術(shù)后惡性腫瘤，從而提高腎移植術(shù)后患者的長(zhǎng)期存活率[4]。相比于其它免疫抑制劑，咪唑立賓還具有骨髓抑制作用弱、消化系統(tǒng)不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[5]。此外，咪唑立賓臨床上也可用于治療狼瘡性腎炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[6]及腎病綜合征[7]等自身免疫性疾病。

咪唑立賓主要通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾、提取、精制、脫色、結(jié)晶等過(guò)程得到產(chǎn)品。傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝所得產(chǎn)品多為咪唑立賓一水合物，該化合物性質(zhì)不穩(wěn)定，不便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。為提高咪唑立賓的穩(wěn)定性，專(zhuān)利[8]公開(kāi)了一種將咪唑立賓一水合物加入到乙醇中加熱回流制備無(wú)水咪唑立賓的方法，所得無(wú)水咪唑立賓的性質(zhì)穩(wěn)定。但該方法所得產(chǎn)品晶粒細(xì)小，制劑分裝困難，不利于工業(yè)生產(chǎn)。鑒于此，作者對(duì)咪唑立賓的結(jié)晶工藝進(jìn)行優(yōu)化，探究抗溶劑種類(lèi)、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量對(duì)咪唑立賓結(jié)晶純度、堆密度、收率和產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

咪唑立賓粗品(純度85%)，華北制藥集團(tuán)華勝有限責(zé)任公司；甲醇、乙醇、丙酮，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀(SPD-M20A 型紫外檢測(cè)器，LC-20AT型泵，SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10AS型柱溫箱)，日本Shimadzu公司；OptiMax 1001型結(jié)晶器(反應(yīng)釜 500 mL)， Mettler-Toledo公司；Leica DM500-ICC50型顯微鏡。

1.2 方法

將咪唑立賓粗品溶解于一定體積、一定溫度的純化水中制成溶液，以不同滴加速度加入一定量抗溶劑，抗溶劑加量為水溶液體積的8～12倍；加料結(jié)束后養(yǎng)晶3～6 h，過(guò)濾，用抗溶劑洗滌濾餅，干燥，即得咪唑立賓結(jié)晶產(chǎn)品。

對(duì)咪唑立賓結(jié)晶過(guò)程中抗溶劑種類(lèi)、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量進(jìn)行優(yōu)化，以提高咪唑立賓結(jié)晶純度、堆密度和收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶工藝優(yōu)化

2.1.1 抗溶劑種類(lèi)選擇

配制濃度為0.5 g·mL-1的咪唑立賓水溶液，分別以甲醇、乙醇、丙酮為抗溶劑進(jìn)行結(jié)晶，抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的10倍，滴加速度為6 BV·h-1，滴加完畢后養(yǎng)晶4 h，考察抗溶劑種類(lèi)對(duì)結(jié)晶效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抗溶劑種類(lèi)對(duì)結(jié)晶效果的影響

由表1可知，使用3種抗溶劑均可以得到結(jié)晶產(chǎn)品。綜合考慮，以乙醇為抗溶劑時(shí)，結(jié)晶產(chǎn)品可獲得更好的純度、堆密度和收率。

2.1.2 溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度選擇

在結(jié)晶過(guò)程中，抗溶劑加量過(guò)大會(huì)形成超過(guò)飽和微環(huán)境，容易引發(fā)爆發(fā)成核，致使晶體細(xì)小、晶體團(tuán)聚、溶劑和雜質(zhì)包容在晶簇中，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。降低體系初始濃度可以降低局部的過(guò)飽和度，減少爆發(fā)成核帶來(lái)的負(fù)面影響；而過(guò)低的初始濃度不僅會(huì)增大抗溶劑的消耗量，也會(huì)導(dǎo)致收率下降。因此，尋找恰當(dāng)?shù)某跏紳舛仁强刂瓶谷軇┙Y(jié)晶過(guò)程的關(guān)鍵之一。

抗溶劑與結(jié)晶液的快速混合有利于迅速降低局部的過(guò)飽和度，減少爆發(fā)成核的發(fā)生率。在結(jié)晶設(shè)備參數(shù)固定的情況下，抗溶劑滴加速度是影響溶劑混合的關(guān)鍵。對(duì)溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度兩個(gè)參數(shù)組合進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度對(duì)結(jié)晶效果的影響

由表2可知，溶液初始濃度高、抗溶劑滴加速度快時(shí)收率較高，但純度和堆密度呈下降的趨勢(shì)。咪唑立賓產(chǎn)品質(zhì)量要求純度盡量高，堆密度盡量大。從生產(chǎn)成本控制方面考慮，收率應(yīng)盡量高一些。綜合考慮，在滿足質(zhì)量指標(biāo)要求的前提下，選擇溶液初始濃度為0.7 g·mL-1，抗溶劑滴加速度為5 BV·h-1。

2.1.3 抗溶劑加量選擇

在溶液初始濃度為0.7 g·mL-1、抗溶劑滴加速度為5 BV·h-1的條件下，分別采用8 BV、10 BV、12 BV的抗溶劑加量進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 抗溶劑加量對(duì)結(jié)晶效果的影響

由表3可知，抗溶劑加量主要影響產(chǎn)品收率，對(duì)純度和堆密度影響較小。綜合考慮原材料的成本與產(chǎn)品收率，選擇抗溶劑加量為12 BV最為經(jīng)濟(jì)。

2.2 優(yōu)化工藝放大驗(yàn)證

在優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行了3批工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)工藝驗(yàn)證。稱取14 kg咪唑立賓粗品溶解于20 L純化水中，配制濃度為0.7 g·mL-1的咪唑立賓水溶液。以工業(yè)乙醇為抗溶劑，抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的12倍，滴加速度為5 BV·h-1，滴加完畢后養(yǎng)晶4 h，過(guò)濾、洗滌、干燥得咪唑立賓結(jié)晶產(chǎn)品，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 咪唑立賓結(jié)晶工藝驗(yàn)證結(jié)果

生產(chǎn)工藝驗(yàn)證所得咪唑立賓晶體與重結(jié)晶前咪唑立賓晶體相比，晶體外觀發(fā)生明顯變化，由重結(jié)晶前的塊狀晶體變?yōu)獒槧罹w(圖1)。

圖1 咪唑立賓重結(jié)晶前(a)后(b)晶體的顯微照片

最佳工藝條件下生產(chǎn)放大所得結(jié)晶產(chǎn)品的室溫長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 室溫長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

由表5可知，生產(chǎn)放大所得結(jié)晶產(chǎn)品室溫存放36個(gè)月，純度仍達(dá)到99.6%，僅下降0.2%，表明結(jié)晶產(chǎn)品可長(zhǎng)期存放，穩(wěn)定性好。

優(yōu)化的咪唑立賓粗品結(jié)晶工藝操作簡(jiǎn)單、結(jié)晶收率高，所制備的產(chǎn)品純度高、堆密度較大、穩(wěn)定性好，可滿足制劑工藝要求。

3 結(jié)論

對(duì)咪唑立賓的結(jié)晶工藝進(jìn)行優(yōu)化，探究了抗溶劑種類(lèi)、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量對(duì)咪唑立賓結(jié)晶純度、堆密度、收率和產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響。確定最佳結(jié)晶工藝為：以乙醇為抗溶劑、溶液初始濃度0.7 g·mL-1、抗溶劑滴加速度5 BV·h-1、抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的12倍(12 BV)。該結(jié)晶工藝所得產(chǎn)品純度高、雜質(zhì)少、堆密度較大、穩(wěn)定性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)，有利于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和制劑分裝，對(duì)此類(lèi)藥品的工業(yè)結(jié)晶有較好的應(yīng)用價(jià)值。