貫葉連翹提取物對(duì)大鼠急性偏頭痛模型的改善作用研究

張丹丹 杜惠 毛祈萍 李會(huì)英 何明珍 陳巧巧 歐陽(yáng)輝

偏頭痛是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，癥狀以搏動(dòng)性頭痛為主，發(fā)作時(shí)伴有中度至重度疼痛，隨著運(yùn)動(dòng)或身體活動(dòng)而加劇[1]。偏頭痛在中醫(yī)學(xué)中多屬內(nèi)傷頭痛，屬于中醫(yī)“頭風(fēng)”“腦風(fēng)”“偏頭痛”“厥頭痛”等疾病范疇[2]。目前，偏頭痛的發(fā)病機(jī)制尚不明確，主流學(xué)說(shuō)有血管源學(xué)說(shuō)、皮層擴(kuò)散抑制學(xué)說(shuō)和三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)。貫葉連翹為藤黃科金絲桃屬多年生草木植物，是國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)上重要的抗抑郁植物制劑原料[3]。偏頭痛與焦慮抑郁存在共病機(jī)制[4]，抑郁癥發(fā)病機(jī)制亦與偏頭痛呈現(xiàn)同樣的5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）等神經(jīng)遞質(zhì)水平下降[5]。臨床上首選抗抑郁藥物多以增加突觸單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE的水平為主[6]。因此偏頭痛與抑郁癥的神經(jīng)病理生化基礎(chǔ)均可能與5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)水平降低有關(guān)[7-8]，但能升高5-HT水平的抑郁癥藥物是否可以治療偏頭痛，仍然需要更多的證據(jù)。本研究將貫葉連翹提取物用于硝酸甘油所致急性偏頭痛大鼠，并測(cè)定大鼠血漿5-HT、DA、內(nèi)皮素（ET）以及腦組織前列腺素E2（PGE2）水平，以探究貫葉連翹提取物對(duì)偏頭痛是否具有治療作用，也為抗抑郁藥物和抗偏頭痛藥物的共性機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大鼠48只（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格號(hào)：SLK-2001-02），體重（200±20）g。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，禁食12 h（自由飲水）。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心進(jìn)行，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)JZLLSC2019-0160）。藥物和試劑：貫葉連翹（杭州今同公司）；佐米曲普坦（2.5 mg/片，杭州康恩貝制藥有限公司）；硝酸甘油注射液（5 mg/ml，山東圣魯制藥有限公司，規(guī)格1 ml∶5 mg）；DA測(cè)定試劑盒、ET測(cè)定試劑盒、5-HT測(cè)定試劑盒、PGE2測(cè)定試劑盒（南京建成生物研究所）。

1.2 貫葉連翹提取物的制備 將100 g貫葉連翹干燥藥材放入圓底燒瓶加入10倍量的水浸泡1 h后加熱提取2次（100℃，每次1 h），將2次提取液過(guò)濾合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，在70℃水浴鍋上蒸干得浸膏，計(jì)算得率（得率=浸膏重量/貫葉連翹重量×100%）為28.44%，將浸膏粉碎成細(xì)粉，放入干燥皿中保存待用。

1.3 動(dòng)物分組、造模與給藥方法 將48只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、佐米曲普坦組、貫葉連翹高劑量組、貫葉連翹中劑量組、貫葉連翹低劑量組，每組各8只。除正常對(duì)照組外[正常對(duì)照組皮下注射 0.9%氯化鈉注射液 10 mg/kg（規(guī)格：100 ml∶0.9 g）]，其余各組大鼠采用后頸部皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg方法制備急性偏頭痛模型，以大鼠30 min內(nèi)出現(xiàn)雙耳變紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增加為造模成功[9]。造模成功30 min后給藥，佐米曲普坦組灌胃佐米曲普坦1.0 mg/kg[10]（用0.9%氯化鈉注射液溶解）；劑量設(shè)計(jì)結(jié)合文獻(xiàn)[11]，并參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，貫葉連翹高劑量組灌胃貫葉連翹提取物0.6 g/kg，貫葉連翹中劑量組灌胃貫葉連翹提取物0.3 g/kg，貫葉連翹低劑量組灌胃貫葉連翹提取物0.15 g/kg，正常對(duì)照組與模型組灌胃0.9%氯化鈉注射液10 mg/kg。

1.4 取材與指標(biāo)檢測(cè) 于給藥2 h后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液0.4 ml/100 g麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 ml，離心（4 ℃，3 000 r/min，10 min），取上清液（血漿），測(cè)定血漿中5-HT、DA、ET水平。大鼠取血后脫頸椎處死，剪下頭部取出全腦，將其置于盛有0.9%氯化鈉溶液的培養(yǎng)皿中，洗去血漬，吸干多余水分，保存于-20℃冰箱中備用，用于PGE2水平的檢測(cè)。采用ELISA試劑盒（南京建成生物研究所）測(cè)定血漿5-HT、DA、ET及腦組織PGE2水平，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。因取血及試劑盒數(shù)量等原因，最終各組納入統(tǒng)計(jì)大鼠只數(shù)有所不同。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿5-HT水平比較 與正常對(duì)照組比較，佐米曲普坦組與貫葉連翹高、中、低組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與模型組比較，貫葉連翹高、中、低劑量組顯著增高（P＜0.05或0.01），佐米曲普坦組有上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與佐米曲普坦組比較，貫葉連翹高、中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血漿5-HT水平比較（ng/ml）

2.2 各組大鼠血漿DA水平比較 與正常對(duì)照組比較，佐米曲普坦組顯著增高（P＜0.01），貫葉連翹低劑量組顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，佐米曲普坦組和貫葉連翹高、中劑量組顯著增高（均P＜0.01），貫葉連翹低劑量組有上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與佐米曲普坦組比較，貫葉連翹高、中、低劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠血漿ET水平比較 與正常對(duì)照組比較，佐米曲普坦組與貫葉連翹高、中、低組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與模型組比較，佐米曲普坦組與貫葉連翹高、中、低劑量組顯著增高（均P＜0.01），與佐米曲普坦組比較，貫葉連翹高、中、低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠血漿DA水平比較（ng/ml）

表3 各組大鼠血漿ET水平比較（ng/ml）

2.4 各組大鼠腦組織PGE2水平比較 與正常對(duì)照組比較，貫葉連翹中劑量組顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，佐米曲普坦組顯著增高（P＜0.05），貫葉連翹高、中、低劑量組均顯著增高（均P＜0.01）；與佐米曲普坦組比較，貫葉連翹高、低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），貫葉連翹中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腦組織PGE2水平比較（ng/ml）

3 討論

急性偏頭痛發(fā)作時(shí)的治療在于快速緩解疼痛，目前使用的藥物包括曲坦類藥物、非甾體抗炎藥（NSAIDs）、聯(lián)合巴比妥類鎮(zhèn)痛藥、可待因、嗎啡等阿片類鎮(zhèn)痛藥物和麥角胺加咖啡因[12]。曲坦類藥物除了具有顯著的療效和良好的安全性外，還是治療偏頭痛的首選藥物。研究發(fā)現(xiàn)，口服曲坦類藥物中，佐米曲普坦的療效優(yōu)于舒馬曲坦[1]，是目前偏頭痛一線用藥中的主要藥物，因此本研究選用佐米曲普坦作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。硝酸甘油誘導(dǎo)的急性偏頭痛模型大鼠是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物模型[13-14]，造模后的行為學(xué)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)與偏頭痛患者發(fā)作時(shí)癥狀較吻合，該造模方式能較好地反應(yīng)藥物的抗偏頭痛效果。

貫葉連翹是國(guó)際上銷量較大，藥用價(jià)值較高的天然藥物，傳統(tǒng)民間用法為水煎液服用，近年來(lái)也有將醇提物做為標(biāo)準(zhǔn)提取物進(jìn)行提取銷售。因此貫葉連翹水提取和醇提物可能都有效，目前對(duì)醇提物中的金絲桃素等成分藥效研究較多，而水提物的現(xiàn)代研究較少，故實(shí)驗(yàn)中根據(jù)其民間用法選取了水提取進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)并最終確定了正式試驗(yàn)的高、中、低給藥劑量。貫葉連翹主要用于抗抑郁，由于抑郁癥和偏頭痛存在共病機(jī)制，某些生理生化指標(biāo)的趨勢(shì)一致，因此貫葉連翹提取物可能也可治療偏頭痛，值得深入探討。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)血小板釋放的5-HT[15]、DA、ET、神經(jīng)肽如P物質(zhì)、緩激肽、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）和 β-內(nèi)啡肽（β-endorphin，β-EP）等[16]、由環(huán)氧化物形成的血栓烷素（Thromboxane，TXA2）、前列腺素（prostaglandin，PG）如 PGE2、PGI2[17]均可能與偏頭痛有關(guān)。在生理生化指標(biāo)的選擇上，本研究綜合了大量的文獻(xiàn)，結(jié)合現(xiàn)有一線化學(xué)藥物的起效特點(diǎn)，選擇了具有代表性的5-HT、ET、DA、PGE2指標(biāo)。有研究表明，偏頭痛患者體內(nèi)5-HT代謝紊亂，發(fā)病期間血漿5-HT水平較低，血小板5-HT水平和釋放增加[18]。5-HT是目前公認(rèn)在偏頭痛發(fā)病中起重要作用的神經(jīng)遞質(zhì)，在偏頭痛發(fā)作期血漿5-HT水平是降低的[19]。DA是一種兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中水平較高。臨床研究、生化研究和藥理學(xué)研究均表明DA在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[20]。ET由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是一種很強(qiáng)的縮血管物質(zhì)[5]，ET血管活性物質(zhì)水平的異常變化會(huì)促進(jìn)偏頭痛的發(fā)生[21-22]。前列腺素（PGE2、PGI2、PGD2、PGF2α）不僅介導(dǎo)外周炎癥，還參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理生理的調(diào)節(jié)過(guò)程，其中PGE2、PGI2對(duì)疼痛的信號(hào)處理過(guò)程有重要作用[23]。貫葉連翹是抗抑郁癥的常用中藥，貫葉連翹提取物能抑制5-HT、DA、NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的攝取，使腦部抑郁相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)濃度發(fā)生變化[24]。

研究表明，貫葉連翹能改變慢性應(yīng)激大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平，并具有類似抗慢性應(yīng)激的功效[18]。貫葉連翹能提高慢性應(yīng)激大鼠紋狀體中DA水平，引起海馬和紋狀體中HVA與5-HT水平出現(xiàn)升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示貫葉連翹提取物對(duì)5-HT和DA的調(diào)節(jié)趨勢(shì)與文獻(xiàn)研究一致，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，貫葉連翹提取物對(duì)血漿5-HT水平的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于佐米曲普坦，對(duì)DA水平的調(diào)節(jié)作用較佐米曲普坦弱。此外，貫葉連翹提取物對(duì)ET、PGE2也有一定的調(diào)節(jié)作用，且作用效果與佐米曲普坦一致。提示貫葉連翹提取物可通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)以及血管活性因子的水平，可能對(duì)偏頭痛具有很好的改善作用，貫葉連翹提取物對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用與抗偏頭痛中成藥大川芎方、天麻鉤藤飲、正天丸等接近，但對(duì)ET、PGE2的調(diào)節(jié)作用更優(yōu)，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值[25]。

綜上所述，貫葉連翹提取物對(duì)大鼠體內(nèi)5-HT、DA、ET、PGE2水平具有一定的調(diào)節(jié)作用，并對(duì)硝酸甘油所致大鼠急性偏頭痛有一定的改善作用。下一步，還應(yīng)該采取液質(zhì)聯(lián)用等方法分析水提物的成分，并測(cè)試貫葉連翹提取物對(duì)偏頭痛行為學(xué)指標(biāo)如撓頭次數(shù)、耳紅時(shí)間等的影響，進(jìn)一步確認(rèn)藥物對(duì)偏頭痛的藥效物質(zhì)及作用。