一株沙門氏菌Ⅲb 60：r：e，n，x，z15的分離、鑒定及其檢測方法比較

章志超，鄢雷娜，匡佩琳，*

（1.江西省食品檢驗檢測研究院，江西南昌330001；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西南昌330029）

沙門氏菌是最常見的食源性致病菌之一。根據(jù)生化反應(yīng)和DNA同源性等特征，沙門氏菌屬可分為腸道沙門氏菌和邦戈爾沙門氏菌兩大類，其中腸道沙門氏菌又分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ和Ⅵ，6個亞種[1]。日常食品中畜禽肉類、蛋類、乳類食品最易受沙門氏菌污染，尤其是生鮮類[2-3]。巧克力的高脂、高糖成分為沙門氏菌的生存提供了保護環(huán)境，使細菌更容易到達腸道，引起人體感染[4-5]。沙門氏菌能夠引起人和動物感染敗血癥與胃腸炎等疾病，其中使人類致病的常見沙門氏菌主要來自腸道沙門氏菌腸道亞種（I），如腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞沙門氏菌等[3，6-7]。

目前，傳統(tǒng)培養(yǎng)和生化鑒定仍是食品中沙門氏菌檢測最常用的方法之一，我國食品安全監(jiān)督檢驗也采用了基于此原理建立的方法GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》對沙門氏菌進行檢測[8]。該方法需要至少4 d～6 d才能得出檢測結(jié)果[9]，耗時較長，不利于對該類致病菌污染的快速判斷與相關(guān)突發(fā)事件的及時處置。因此，實際研究中熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、商業(yè)化的BAX System Q7鑒定系統(tǒng)、VITEK2生化鑒定系統(tǒng)、Riboprinter基因指紋鑒定技術(shù)和MiniVIDAS系統(tǒng)等分子生物學(xué)或免疫學(xué)技術(shù)常常被應(yīng)用于沙門氏菌的快速篩查或鑒定當(dāng)中[2，10-11]。

沙門氏菌Ⅲb最早被分離自蛇等冷血動物及環(huán)境中，也被報道檢出于一些畜禽當(dāng)中[1，12-13]。該菌在沙門氏菌常見的食品宿主中被檢出頻率不高，當(dāng)采用GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》的方法進行檢測時，沙門氏菌Ⅲb的部分生化和表型特征不夠典型，往往導(dǎo)致漏檢情況的發(fā)生[14]。同時沙門氏菌及其干擾菌的增菌和分離研究多針對常見的鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等[15-17]，對沙門氏菌Ⅲb在該方面研究的文獻報道不多。本研究在標準方法的基礎(chǔ)上，探討了實驗室常用的商業(yè)化的BAX System Q7、VITEK2系統(tǒng)和Riboprinter基因指紋鑒定技術(shù)在檢測以巧克力為基質(zhì)的沙門氏菌樣品的適用情況及特點，對檢出的沙門氏菌Ⅲb生化和血清型特征檢測過程進行了細致描述，同時比較了沙門氏菌Ⅲb 60：r：e，n，x，z15在不同培養(yǎng)基中的增菌分離特征，形成了一套分離、鑒定沙門氏菌Ⅲb 60：r：e，n，x，z15較優(yōu)的檢測方案，為準確、快速檢測出食品中該類不常見的沙門氏菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巧克力：樣品編號分別為 0716、0752、0362，來自中國食品藥品檢定研究院的NIFDC-PT-135沙門菌能力驗證計劃。腸炎沙門氏菌CICC 24119：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸（selenite cystine，SC）增菌液、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（tetrathionate Broth，TTB）、沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（rappaport-vassiliadis，RV）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（xylose lysine desoxycholate，XLD）瓊脂、亞硫酸鉍（bismuth sulfite，BS）瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、沙門氏菌生化鑒定套裝：北京陸橋生物技術(shù)有限公司；沙門氏菌屬診斷血清：寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；VITEK2革蘭氏陰性菌鑒定卡：法國梅里埃生物公司；BAX Q7沙門氏菌檢測試劑盒、Riboprinter全自動基因指紋圖譜鑒定套裝：美國杜邦公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXSD-A1430生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；BAX System Q7全自動病原微生物檢測系統(tǒng)、RiboPrinter?全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)：美國杜邦公司；VITEK2 Compact 60全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)：法國梅里埃生物公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)增菌

將巧克力樣品加入90 mL滅菌的BPW中，參照GB/T 4789.24-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 糖果、糕點、蜜餞檢驗》[18]融化樣品，充分均質(zhì)混勻后，于36℃靜置培養(yǎng)18 h。

1.3.2 增菌、選擇性分離、生化鑒定和血清型鑒定

樣品預(yù)增菌后，參照GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》[9]方法依次進行增菌、選擇性分離、傳統(tǒng)生化鑒定和血清型鑒定。同時挑取可疑菌，純化后進行VITEK2上機鑒定。

1.3.3 目標菌分子初篩

將樣品培養(yǎng)后BPW、TTB增菌液和SC增菌液作為檢測對象，參照BAX Q7沙門氏菌檢測試劑盒進行檢測，依次完成加入裂解試劑、孵育、裂解過程，加入到PCR反應(yīng)試劑后擴增，結(jié)果自動分析等步驟，對目標菌進行初篩。

1.3.4 目標菌基因指紋鑒定確證

生化鑒定為陽性的菌株經(jīng)活化后，加入200 μL樣品專用緩沖液，振蕩混勻，取30 μL菌懸液進行熱處理后，每管分別加入裂解液A和B各5 μL，根據(jù)儀器提示放入相應(yīng)反應(yīng)試劑進行檢測和分析。

1.3.5 菌株在不同培養(yǎng)基上的生長指數(shù)測定

將分離得到的沙門氏菌Ⅲb和其干擾菌，弗氏檸檬酸桿菌、摩根氏菌摩根亞種和奇異變形桿菌分別經(jīng)TTB、SC、RV 培養(yǎng)基增菌后，參照 GB 4789.28-2013《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[19]中“目標菌半定量劃線法”的方法分別劃線XLD、TTB和BS固體培養(yǎng)基，并按標準規(guī)定進行培養(yǎng)，重復(fù)試驗2次，并統(tǒng)計生長指數(shù)，以腸炎沙門氏菌CICC 24119作為陽性參照菌。結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

圖1 PCR熔解曲線圖Fig.1 PCR melting curve

2 結(jié)果與分析

2.1 分子初篩結(jié)果分析

按照GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》中沙門氏菌檢測方法流程進行增菌后，采用BAX System Q7系統(tǒng)分別對BPW、SC和TTB增菌液進行沙門氏菌檢測，如圖1所示。

采用BPW預(yù)增菌后，檢測未得到正常的熔解曲線，顯示信號錯誤。SC和TTB增菌液對應(yīng)的PCR鏈熔解曲線圖均有內(nèi)部質(zhì)控峰，試驗有效。樣品0362和樣品0752的兩種增菌液對應(yīng)的PCR鏈熔解曲線均無目標峰，表示未檢出沙門氏菌；樣品0716經(jīng)SC增菌后，PCR鏈熔解曲線圖中出現(xiàn)目標峰，且遠高于質(zhì)控峰，顯示為強陽性結(jié)果，表明SC增菌液中沙門氏菌濃度較高；而樣品0716經(jīng)TTB增菌后，經(jīng)檢測質(zhì)控峰遠大于目標峰，顯示為弱陽性結(jié)果。

由分子初篩結(jié)果可知，選擇不同增菌液經(jīng)BAX System Q7系統(tǒng)檢測，結(jié)果差異較大。由于巧克力樣品直接溶解于BPW中增菌，導(dǎo)致加入反應(yīng)體系的增菌液中含有較多脂肪，且顏色較深等因素可能對試驗結(jié)果造成干擾。Jasson等[5]指出巧克力樣品的低水分活度等特性，其中沙門氏菌污染量往往極低，且微生物多呈受損傷狀態(tài)。因此采用TTB等一些選擇性強的增菌液作為上機模板很可能得到假陰性結(jié)果。研究采用的巧克力樣品SC增菌液適合該儀器檢測，樣品經(jīng)增菌后，僅需約3.5 h出結(jié)果，結(jié)果與指定結(jié)果相符，具有準確、快速的特點。與普通PCR和熒光PCR方法相比，該方法簡化了DNA提取與反應(yīng)體系配制流程，且反應(yīng)體系采用了干粉制劑，僅需加入DNA模板便可上機檢測，操作簡單，降低了對檢測人員的分子生物實驗操作的技術(shù)要求。因此，鄧曉麗等[20]檢測金黃色葡萄球菌時也指出該方法適合基層檢測人員對致病菌的快篩應(yīng)用。

2.2 培養(yǎng)微生物選擇性分離

樣品經(jīng)增菌培養(yǎng)后，采用3種不同的選擇性固體培養(yǎng)基分別對TTB增菌液和SC增菌液進行劃線分離。樣品0362和0752對應(yīng)的增菌液澄清，選擇性平板上均無菌落生長，未檢出沙門氏菌，與分子初篩結(jié)果一致。樣品0716的增菌液渾濁，選擇性平板上均有菌落生長，如圖2所示。

圖2 樣品增菌液在不同選擇性分離培養(yǎng)基上的劃線分離結(jié)果Fig.2 The streaking results of different enrichment medium

同等劃線條件下，SC增菌液劃線菌落顯著多于TTB增菌液；沙門顯色培養(yǎng)基的選擇性則更強，平板上細菌種類少，且只在劃線1-2區(qū)有菌落生長。

在XLD平板上分離得到：菌落邊緣接近透明，帶較大黑色中心（菌落Z-1）；菌落較小，邊緣接近透明，有中心黑點（菌落Z-2）；菌落呈黃色，飽滿、光滑濕潤（菌落Z-3）；菌落呈黃色，扁平略有凹陷、干燥（菌落Z-4）。在BS平板上分離得到：菌落黑色，略帶金屬光澤（菌落Z-5）；菌落邊緣接近棕色，帶黑色中心且無金屬光澤（菌落Z-6）。在沙門顯色平板上分離得到：菌落呈淺棕灰色或淺紅色（菌落Z-7、Z-8），同時按照沙門顯色培養(yǎng)基使用說明，將生長的一些綠色菌落視為非可疑菌。

2.3 可疑菌生化鑒定

參照GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》對分離得到的可疑菌進行生化鑒定，鑒定結(jié)果見表1。

表1 可疑菌的生化鑒定Table 1 Biochemical identification of suspected bacteria

菌株 Z-1、Z-2、Z-6、Z-7 和 Z-8 的賴氨酸脫羧酶反應(yīng)陰性、pH7.2尿素反應(yīng)陽性，鑒定為非沙門氏菌，同時VITEK2鑒定為奇異變形桿菌（相似度均為99%）；菌株Z-4在三糖鐵瓊脂上反應(yīng)和賴氨酸脫羧酶反應(yīng)表明該菌不是沙門氏菌，VITEK2鑒定為弗氏檸檬酸桿菌（相似度99%）；菌株Z-5的pH7.2尿素和靛基質(zhì)反應(yīng)均為陽性，初步判斷該菌不是沙門氏菌，VITEK2鑒定也確證該菌為摩根氏菌摩根亞種（相似度99%）；在初步生化鑒定的基礎(chǔ)上，菌株Z-3進一步進行了沙門氏菌屬的生化群相關(guān)生化反應(yīng)試驗，結(jié)果表明：該菌與沙門氏菌屬生化群Ⅲ吻合，同時VITEK2鑒定為沙門氏菌Ⅲb（相似度96%），因此可以確定該菌為沙門氏菌，樣品0716為陽性樣品。由此可見，在沙門氏菌Ⅲb的檢測中，VITEK2較傳統(tǒng)鑒定方法更有優(yōu)勢：操作簡單、快速，能夠直接鑒定到種水平。

試驗中沒有從BS平板和沙門顯色平板上挑取到陽性菌株，為了進一步確定該菌在這兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，將菌株Z-3活化后接種于上述兩種培養(yǎng)基中。菌落形態(tài)如圖3所示。

圖3 沙門氏菌Ⅲ b分別接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和BS瓊脂上的菌落形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of colonies of Salmonella Ⅲ b in salmonella chromogenic agar and BS agar

陽性菌株Z-3在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上菌落邊緣接近透明，略帶淺紅色，綠色菌落中心；在BS平板上則菌落較小，邊緣透明，中心黑色。該陽性菌在沙門顯色培養(yǎng)基上不是培養(yǎng)基說明書上提示的典型（淺）紫紅色菌落，在BS平板上則由于干擾菌的存在，且目標菌菌落太小，因此導(dǎo)致試驗中陽性菌在這兩類平板上未被篩選得到。同時需要指出的是：XLD平板上弗氏檸檬酸桿菌與沙門氏菌Ⅲb 60：r：e，n，x，z15菌落特征非常接近，不易區(qū)分。不少學(xué)者在檢測沙門氏菌Ⅲb時均提出了與本研究類似的問題，認為該類沙門菌的檢測難度較大，對檢驗人員的技術(shù)水平要求較高[15，21]。同時，一些對沙門氏菌的選擇性培養(yǎng)或干擾菌研究報道多基于典型菌落特征的常見沙門氏菌進行分析，未將沙門氏菌Ⅲb考慮在內(nèi)，導(dǎo)致結(jié)果略顯片面[15]

2.4 目標菌血清學(xué)分型

按照國標進一步對菌株Z-3的血清型分析，結(jié)果表明：菌株Z-3不被常用的O多價A-F血清凝集，容易導(dǎo)致漏檢誤判。當(dāng)進一步采用其它O血清試驗時，菌株Z-3能夠被O60凝集。同時對菌株Z-3進行H血清的第一相和第二相檢查，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠為r血清凝集。為了確定其它H血清凝集情況，參照GB 4789.4-2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》中的簡易平板法進行抑制誘導(dǎo)[9]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)后，H 血清中 e，n，x，z15能夠凝集菌株 Z-3。參照相關(guān)文獻[22]，最終生化鑒定確定為沙門氏菌屬的菌株Z-3 的血清型為：60：r：e，n，x，z15。

2.5 陽性菌基因指紋鑒定

為進一步確證篩選到的陽性菌株，選用RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)對菌株Z-3進行鑒定，試驗中選用PvuII限制性內(nèi)切酶對菌的基因組進行處理，如表2所示。

表2 菌株Z-3的RiboPrinter系統(tǒng)鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of Z-3 analyzed by RiboPrinter system

菌株Z-3的兩次鑒定結(jié)果均為沙門氏菌Ⅲb 60：r：e，n，x，z15，相似度分別為 93%和 92%，大于 85%，結(jié)果可信。這與上述生化和血清型鑒定結(jié)果一致。由2.4可知，與常見的沙門菌相比，沙門氏菌Ⅲb的血清型鑒定試驗更為繁瑣，且要求實驗室儲備的鑒定血清種類較全，才能夠得到準確結(jié)果。本研究采用的Riboprinter鑒定系統(tǒng)能夠為沙門氏菌Ⅲb的血清型判斷提供良好的參考，但在該類菌的應(yīng)用研究報道不多，多應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌等一些常見的沙門菌的鑒定和分型[10，23]。

2.6 不同分離條件下目標菌和干擾菌的生長情況比較

由于上述4種鑒定方法在沙門菌Ⅲb的篩選和鑒定中都離不開樣品增菌或劃線分離等篩選程序，因此為了獲得更好的檢測方案，有必要比較不同增菌液和分離培養(yǎng)基組合對沙門氏菌的分離效果。腸炎沙門氏菌是導(dǎo)致沙門氏菌病最常見的病原之一[3]，代表一類在菌落形態(tài)典型（XLD平板上呈邊緣透明，中心黑色；BS平板上為帶有金屬光澤的棕褐色菌落；沙門顯色培養(yǎng)基上為紫紅色菌落）的常見沙門氏菌，因此研究中以腸炎沙門氏菌CICC 24119為參照比較菌。結(jié)合樣品中分離得到的陽性菌和干擾菌的選擇性生長和菌落特征表征兩方面，對國內(nèi)外主要的沙門菌檢測標準使用的幾種分離培養(yǎng)基進行了培養(yǎng)效果比較[9，24]。沙門氏菌及其干擾菌在不同分離培養(yǎng)基上的生長指數(shù)檢測結(jié)果如表3所示。

SC培養(yǎng)基增菌選擇性較差，接種劃線BS分離培養(yǎng)基時，僅弗氏檸檬酸桿菌生長指數(shù)較小，其它接種情況下，各干擾菌和參照菌生長良好，與沙門氏菌Ⅲb的生長差異不大，生長指數(shù)無顯著性差異。3種干擾菌經(jīng)TTB培養(yǎng)后，生長指數(shù)接近0，幾乎被完全抑制；兩種沙門氏菌經(jīng)TTB培養(yǎng)，劃線相同培養(yǎng)基后，生長指數(shù)無顯著性差異，生長指數(shù)處在4～9之間。可見，TTB雖然對沙門氏菌增殖效果不如SC，但總體具有良好的生長選擇性。BAX System Q7系統(tǒng)的檢測結(jié)果也印證了SC和TTB對沙門氏菌的增殖特點。RV培養(yǎng)基對3種干擾菌同樣具有良好的抑制效果，同時RV對沙門氏菌Ⅲb也有一定的抑制作用，因此更適合腸炎沙門氏菌等常見沙門氏菌的增殖。因此分析試驗結(jié)果可知，在沙門氏菌的分離過程中，增菌液較選擇性固體培養(yǎng)基對目標菌的選擇生長方面發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用，后者更大的作用則體現(xiàn)在目標菌菌落特征的表征方面。SC培養(yǎng)基適合沙門菌含量極低、菌群結(jié)構(gòu)簡單的樣品增菌；TTB和RV培養(yǎng)基則適合沙門菌含量較高，菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜的樣品分離目標菌，其中TTB較RV更適合沙門氏菌Ⅲb的增菌。

表3 沙門氏菌及其干擾菌的在不同分離培養(yǎng)基上的生長指數(shù)Table 3 Growth index of Salmonella and interfering strains in different selective medium

3 結(jié)論

樣品0752和0362均檢出沙門氏菌，樣品0716檢出沙門氏菌Ⅲb 60：r：e，n，x，z15。檢測結(jié)果與指定值相符，結(jié)果滿意。該菌的傳統(tǒng)生化鑒定需要結(jié)合生化群鑒別試驗，常用的O多價A-F血清也不凝集，必要時還需結(jié)合文獻進行輔助判斷，因此整個檢驗流程均容易漏篩誤判。國家標準方法對該類不常見致病菌鑒定時，耗時長達7 d以上，借助BAX System Q7、VITEK2和Riboprinter3系統(tǒng)均能夠有效縮短檢測時間，起到相互驗證的目的。VITEK2系統(tǒng)和RiboPrinter系統(tǒng)均能夠?qū)ι抽T氏菌Ⅲb 60：r：e，n，x，z15鑒定到種水平，且后者能給出血清型。當(dāng)沙門氏菌含量較低，且存在多種干擾菌的陽性巧克力樣品中，預(yù)增菌后采用TTB增菌，XLD或沙門顯色培養(yǎng)基分離后，經(jīng)RiboPrinter系統(tǒng)鑒定能夠更高效地篩選得到沙門氏菌Ⅲb 60：r：e，n，x，z15。