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    HPLC-MS/MS法測(cè)定腌制食品中色素含量的預(yù)處理方法比較

    2020-11-24 06:26:04鐘萍陳鮮麗羅威李亞楠
    食品研究與開發(fā) 2020年21期
    關(guān)鍵詞:蘇丹紅萃取柱色素

    鐘萍,陳鮮麗,羅威,*,李亞楠

    (1.湛江幼兒師范專科學(xué)校,廣東湛江524084;2.嶺南師范學(xué)院基礎(chǔ)教育學(xué)院,廣東湛江524037;3.韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,廣東韶關(guān)512026)

    蘇丹紅I~I(xiàn)V、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B均為合成色素,既可用于石油、機(jī)油等化工產(chǎn)品的調(diào)色,也可用于皮革、紡織品或家具的涂染[1-2]。由于上述化合物的結(jié)構(gòu)中均有偶氮結(jié)構(gòu),人體若長(zhǎng)期接觸,會(huì)對(duì)肝、腎臟器產(chǎn)生強(qiáng)烈毒性作用,并有致癌風(fēng)險(xiǎn)[3-4],因此國(guó)內(nèi)外食品安全監(jiān)管部門明確要求,不允許將其作為食品添加劑使用,因此建立高效、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,對(duì)相關(guān)食品的安全監(jiān)管意義重大。

    目前蘇丹紅I~I(xiàn)V、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[5]、薄層色譜法[6]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[7-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS)[9-10]、氣相色譜法[11]及酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[12]等。其中以HPLC法和HPLC-MS/MS法應(yīng)用最為常見,但高效液相色譜法的靈敏度較低,且易受共存組分的干擾,而其與質(zhì)譜聯(lián)用后,可克服上述缺點(diǎn),具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)且定性與定量準(zhǔn)確等特點(diǎn),利于排除液相色譜的假陽(yáng)性結(jié)果,因而利用HPLCMS/MS法檢測(cè)腌制肉類食品中合成色素的研究被廣泛報(bào)道[13-15],但不同預(yù)處理樣品方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,卻鮮有提及。因此,本研究分別采用液液萃取-凝膠滲透色譜(liquid liquid extraction-gel permeation chromatography,LLE-GPC)法、固相萃取法(solid-phase extraction,SPE)和QuEChERS法預(yù)處理腌制肉類食品后,利用HPLC-MS/MS法測(cè)定合成色素的含量,從而為相關(guān)食品中合成色素的定量檢測(cè)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥90.0%):上海安譜科學(xué)儀器有限公司;臘腸:市售;甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨、乙酸乙酯、環(huán)己烷、正己烷、二氯甲烷均為色譜純:德國(guó)默克公司;乙酸、無(wú)水硫酸鈉均為分析純:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硅膠(C18)填料、N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)填料、Bio-Beads S-X3填料:天津博納艾杰爾科技有限公司;試驗(yàn)用水為高純水(電阻率大于18.2 MΩ·cm)。

    PL-GPC220凝膠滲透色譜儀、Agilent 1200高效液相色譜:美國(guó)安捷倫科技公司;API 4000四極桿質(zhì)譜儀:美國(guó)PE公司;ME204電子天平:梅特勒-托利多公司;LG-22M高速冷凍離心機(jī):四川蜀科儀器有限公司;FV64全自動(dòng)氮吹濃縮儀:廣州得泰儀器科技有限公司;FRQ-1020超聲波清洗器:溫州百亞超聲設(shè)備有限公司;XH-D渦旋混合器上海冠森生物科技公司;HN-98IB組織勻漿機(jī):上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    1.2.1.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

    分別準(zhǔn)確稱取蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg(精確至0.000 1 g),共置于100 mL容量瓶?jī)?nèi),用乙腈稀釋至刻度線定容、搖勻,即得0.1 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

    1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    分別精密移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 mL,置于 100 mL 容量瓶?jī)?nèi),用乙腈稀釋至刻度線定容、搖勻,配制成濃度為0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

    1.2.2 儀器工作條件

    1.2.2.1 凝膠滲透色譜條件

    凝膠色譜柱(400 mm×25 mm),填料為Bio-Beads S-X3(0.037 mm~0.075 mm);淋洗液:乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,體積比);流量:5.0 mL/min;進(jìn)樣體積:5 mL。

    1.2.2.2 液相色譜條件

    Agilent Zorbax SB C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫為 30 ℃;流量為 1.0 mL/min;進(jìn)樣體積10 μL;流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸、流動(dòng)相 B 為乙腈;梯度洗脫程序:0~4 min 60%B;6 min~8 min時(shí),B線性升高至100%;10 min~12 min時(shí)B線性降低至60%后,保持8 min。

    1.2.2.3 質(zhì)譜條件

    電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI);掃描方式為正離子掃描模式;檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multi-reaction monitoring,MRM);離子源溫度600℃;氣簾氣流量30 L/min;霧化氣流量40 L/min;輔助干燥氣流量50 L/min;噴霧電壓為5 200 V。

    MRM監(jiān)測(cè)模式下7種合成色素的特征離子及其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

    表1 7種合成色素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimal mass parameters for the seven kinds of synthetic colorants

    1.2.3 LLE-GPC法

    1.2.3.1 樣品制備

    超市購(gòu)置的臘腸食品,搗碎后混勻,置于組織勻漿機(jī)內(nèi),完全粉碎制得供試樣品。

    1.2.3.2 待測(cè)物提取

    準(zhǔn)確稱取粉碎完全后的樣品2.0g(精確至0.0001g),置于50 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi),精密移取20 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,體積比),搖勻后渦旋振蕩15 min后,加入2 g無(wú)水硫酸鈉,繼續(xù)振蕩10 min后靜置至上層溶液澄清,離心7 min后(轉(zhuǎn)速:4 500 r/min),吸取上清液,重復(fù)上述步驟,合并兩次提取液,過(guò)0.45 μm濾膜,即得提取溶液。

    1.2.3.3 GPC純化

    精密移取提取溶液10 mL,采用1.2.2.1凝膠滲透色譜條件凈化1.2.3.2中提取液,收集22 min~28 min洗脫液后,于40℃氮?dú)鉂饪s蒸干,殘余物采用乙腈定容至1.0 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后,上樣至高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)。

    1.2.4 SPE純化

    精密移取提取溶液10 mL至活化后的Thermo SCX固相萃取柱,經(jīng)50 mL正己烷淋洗去除油脂后,采用20 mL二氯甲烷洗脫,收集洗脫液,于40℃氮?dú)鉂饪s蒸干,采用乙腈定容至1 mL后,過(guò)0.22 μm濾膜,待測(cè)。

    1.2.5 QuEChERS法

    準(zhǔn)確稱取粉碎完全后的樣品2.0g(精確至0.0001g),置于50 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi),加入20 mL乙腈-水(1∶1,體積比),渦旋振蕩15 min后,加入2 g無(wú)水硫酸鈉,繼續(xù)振蕩 10 min,離心 7 min后(轉(zhuǎn)速:4 500 r/min),吸取上清液,重復(fù)上述步驟,合并兩次提取液后,精密移取10 mL,加入至裝有100 mg硅膠(C18)吸附劑的聚四氟乙烯離心管內(nèi),渦旋振蕩5 min后,離心5 min(轉(zhuǎn)速:4 500 r/min),吸取上清液,過(guò) 0.22 μm 濾膜,待測(cè)。

    1.2.6 基質(zhì)干擾評(píng)價(jià)

    為評(píng)估不同預(yù)處理方法的試驗(yàn)條件對(duì)基質(zhì)干擾的去除效果,在乙腈和空白臘腸中分別加入等體積1.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,照公式:基質(zhì)效應(yīng)(ME/%)=|(A/B-1)|×100,(式中:A為空白臘腸中色素的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度;B為乙腈中色素的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度)計(jì)算采用不同預(yù)處理方法試驗(yàn)條件的基質(zhì)效應(yīng)。參考相關(guān)文獻(xiàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16],當(dāng)ME/%<10%不存在基質(zhì)干擾,10%<ME/%<20%時(shí),為低程度干擾,20%<ME/%<50%時(shí),為中程度干擾,ME/%>50%時(shí),則基質(zhì)嚴(yán)重干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同化合物的色譜圖

    根據(jù)7種合成色素的特征離子,在MRM監(jiān)測(cè)模式下不同化合物的總離子流圖,見圖1,LLE-GPC法中凝膠滲透色譜分離,見圖2。

    圖1 7種合成色素的總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram of seven kinds of synthetic colorants

    2.2 線性范圍與檢出限

    圖2 GPC純化加標(biāo)樣品色譜圖Fig.2 The Gel permeation chromatogram

    采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,利用HPLC-MS/MS法測(cè)定不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度(y)作縱坐標(biāo),7種合成色素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)以3倍信噪比(S/N)為檢測(cè)限,以10倍信噪比(S/N)為定量限,得到不同分析物在一定線性范圍下的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限與定量限,結(jié)果見表2。

    2.3 LLE-GPC法條件優(yōu)化

    2.3.1 提取溶劑選擇

    提取溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度,為保證樣品中目標(biāo)化合物完全富集,選擇不同提取溶劑,照1.2.3.2步驟,分別萃取1.2.6中樣品溶液,考察正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,體積比)和乙酸乙酯-正己烷(1∶1,體積比)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同提取溶劑的ME/%均低于10%,但考慮后續(xù)凝膠色譜凈化的洗脫液為乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,體積比),因此確定乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,體積比)為提取溶劑。

    表2 線性范圍、線性回歸方程、方法檢測(cè)限與定量限Table 2 Linear ranges,linear regression equation,limit of detection and limit of quantitation

    2.3.2 提取次數(shù)選擇

    提取次數(shù)間接反映提取效率,照1.2.3.2步驟,分別考察提取次數(shù)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),樣品溶液經(jīng)兩次提取后,對(duì)不同色素的基質(zhì)效應(yīng)可降低至5%以下,因此確定提取次數(shù)為兩次。

    2.4 SPE法條件優(yōu)化

    2.4.1 固相萃取柱選擇

    固相萃取需利用固相萃取柱選擇性吸附目標(biāo)化合物,經(jīng)液相淋洗除雜后,再選擇性洗脫待測(cè)組分,從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的分離、凈化與富集,因此選擇不同類型固相萃取柱,照1.2.3.2步驟,分別處理1.2.6中樣品溶液,考察 Dikma ProElut Silica、Agilent Bond Elut PSA、Thermo SCX固相萃取柱對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果見圖3。

    圖3 固相萃取柱對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.3 The effect of solid phase extraction column on matrix effect

    從圖3可知,相較其它兩種固相萃取柱,采用Thermo SCX固相萃取柱的基質(zhì)效應(yīng)可降低至10%以下,這歸因于待測(cè)7種合成色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均存在苯環(huán)偶氮結(jié)構(gòu),易形成季銨鹽陽(yáng)離子,構(gòu)成π-π共軛穩(wěn)定體系,而Thermo SCX固相萃取柱的固定相為苯磺酸基,具有強(qiáng)陽(yáng)離子交換作用[17],因此對(duì)上述合成色素均有較好保留,從而可有效去除基質(zhì)干擾,因此選擇采用Thermo SCX固相萃取柱。

    2.4.2 洗脫劑選擇

    提取溶液上樣至固相萃取柱后,經(jīng)正己烷洗滌去除油脂、蛋白質(zhì)和非極性的雜質(zhì)后,采用洗脫劑選擇性洗脫待測(cè)組分,因此考察等體積的不同洗脫劑(甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與其它洗脫劑相比,二氯甲烷對(duì)目標(biāo)化合物檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng),可降至最低,因此采用二氯甲烷作為洗脫劑。

    2.5 QuEChERS法條件優(yōu)化

    2.5.1 提取劑選擇

    由于7種合成色素的水溶性較好,化學(xué)性質(zhì)相近,因此分別選擇等體積的不同溶劑(乙腈、乙腈-水(1∶1,體積比)、水、甲醇、甲醇-水(1∶1,體積比))作為提取劑,照1.2.5步驟,預(yù)處理1.2.6中樣品溶液,考察對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)采用乙腈-水(1∶1,體積比)提取時(shí),對(duì)7種合成色素檢測(cè)的平均基質(zhì)效應(yīng)最低(4.7%),這可能歸因于乙腈-水(1∶1,體積比)提取目標(biāo)物和其它極性雜質(zhì)后,加入無(wú)水硫酸鈉發(fā)生鹽析效應(yīng),促使乙腈與水分層,從而除去溶于水相的蛋白質(zhì)、糖分等雜質(zhì)[18],因此選用乙腈-水(1∶1,體積比)作為QuEChERS法預(yù)處理的提取劑。

    2.5.2 吸附劑選擇

    QuEChERS法常用 C18、N-丙基乙二胺(PSA)作為吸附劑,以去除提取溶劑中的糖類和蛋白質(zhì),因此分別照1.2.5步驟,預(yù)處理1.2.6中樣品溶液,考察不同種類與用量的吸附劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 吸附劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.4 The effect of adsorbent on matrix effect

    從圖4可知,當(dāng)吸附劑為PSA時(shí),樣品基質(zhì)對(duì)合成色素檢測(cè)時(shí)干擾較小,7種色素的平均基質(zhì)效應(yīng)為5%左右,而C18相對(duì)較高,可能歸因于對(duì)部分色素具有一定吸附作用,另外隨著PSA用量的增多,平均基質(zhì)效應(yīng)降低并不明顯,因此選擇100 mg PSA作為QuEChERS法預(yù)處理的吸附劑。

    2.6 不同預(yù)處理方法結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度

    為考察3種預(yù)處理方法結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度,采用回收率表示結(jié)果準(zhǔn)確度,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)表示結(jié)果的精密度,分別照1.2.3、1.2.4和1.2.5所述步驟,預(yù)處理3個(gè)水平(0.50、1.0、5.0 μg/mL)的加標(biāo)樣品,進(jìn)行回收試驗(yàn),每個(gè)水平平行測(cè)定5次,結(jié)果見表3。

    表3 不同預(yù)處理方法的測(cè)定結(jié)果回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 3 The average recoveries and RSDs of results in different pretreatment methods(n=5)

    從表3可知,SPE法的不同濃度水平的平均回收率在70%~110%之間,而QuEChERS法與LLE-GPC法的不同濃度水平的平均回收率均在90%~110%之間,優(yōu)于SPE法,這可能歸因于提取溶液在固相萃取時(shí),未被完全洗脫,3種方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于5%。與LLE-GPC法、SPE法相比,QuEChERS法的提取、除雜、純化過(guò)程簡(jiǎn)便、快速,且無(wú)需昂貴的儀器與耗材,因而綜合預(yù)處理效率較高,適于相關(guān)產(chǎn)品的快速檢測(cè)。

    3 結(jié)論

    采用液液萃取-凝膠滲透色譜法、固相萃取法和QuEChERS法預(yù)處理腌制肉類食品后,利用高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定其合成色素的含量,固相萃取法的不同濃度水平的平均回收率在80%~110%之間,而QuEChERS法與液液萃取-凝膠滲透色譜法的不同濃度水平的平均回收率均在90%~110%之間。與液液萃取-凝膠滲透色譜法、固相萃取法相較,QuEChERS法預(yù)處理樣品的操作更為簡(jiǎn)便、快速,且處理成本適中,綜合預(yù)處理效率較高,因此適用于腌制肉類食品中合成色素的測(cè)定。

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