rBTI對鱸魚魚糜凝膠特性的影響

胡倩楠，韓宇航，李晨

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

鱸魚具有生長速度快、抗病能力強、適應性強等特點，既能在淡水中養(yǎng)殖又能在海水中生存。鱸魚肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，備受消費者喜愛，是許多國家重要的經(jīng)濟魚類[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鱸魚含有多種營養(yǎng)成分，富含人體所需的必需氨基酸、維生素B、維生素D、DHA等，含有多種微量元素如鋅、鈣、鐵、磷等[2]。近年來，市場對鱸魚的需求每年都在增加。然而目前鱸魚以鮮銷為主，對鱸魚的加工目前只局限于較為初級的速凍品，產(chǎn)品形式比較單一，缺乏更精更深的加工，鱸魚多元化制品有待進一步開發(fā)[3]。

魚糜制品具有口感好、低固醇、高蛋白、低脂肪等優(yōu)點，受到消費者青睞，市場前景廣闊。內(nèi)源酶活性對食品安全與品質(zhì)有重要影響，魚肉水分含量較高，所含內(nèi)源酶類較多，不僅影響其凝膠能力，而且極其容易變質(zhì)腐敗[4]。目前通常采用添加劑來改善肉糜制品的凝膠特性，常用的添加劑有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）、水溶性凝膠、多糖類、非肉類蛋白質(zhì)等[5-7]。然而，減少非肉組分的添加是凝膠類肉制品行業(yè)面臨的一個挑戰(zhàn)。由于肌原纖維蛋白是形成肉類凝膠的主要大分子，內(nèi)源酶對蛋白分子的降解是魚肉凝膠劣化的重要原因，因此篩選合適的蛋白酶抑制劑是解決蛋白凝膠劣化提高肉糜品質(zhì)的一個有效途徑[8]。重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI）是一個相對分子質(zhì)量為7.9 kDa的小分子蛋白，特異抑制胰蛋白酶的活性，具有很好的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性[9]。近期研究表明，rBTI還可以延緩秀麗隱桿線蟲的健康壽命[10-11]，具有良好的應用前景。目前用于食品領(lǐng)域的酶抑制劑均為小分子化合物，有關(guān)多肽或蛋白類的酶抑制劑在食品科學的應用研究尚屬空白。本研究綜合評價蛋白酶抑制劑對魚糜凝膠特性及穩(wěn)定機制的影響，將為其在肉制品的應用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與儀器

大腸桿菌（E.coli M15 pQE30-BTI）：山西大學生物技術(shù)研究所蛋白質(zhì)工程實驗室構(gòu)建保存；胰蛋白酶（250 U/mg）、硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate，Kan）、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethy）methyl aminomethane，Tris]、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、Ni2+-NAT親和材料、咪唑、牛血清白蛋白、醋酸、鹽酸、二甲基亞砜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）所用試劑：生工生物工程（上海）股份有限公司；苯甲酰-DL-精氨酰-對硝基苯胺（N-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride，BAp－NA）、Folin-酚試劑：北京索萊寶科技有限公司。

新鮮鱸魚（大口黑鱸）：山西省太原市田合活鮮水產(chǎn)市場。

TU-1810紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司；G154DS高壓蒸汽滅菌鍋：上海輔澤商貿(mào)有限公司；THZ-C-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設備廠；JY92-IIDN超聲破碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；BSA224S精密電子天平、PB-10精密pH計：德國Sartorius公司；BioLogicLP低壓液相層析系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；INFINITY 3026凝膠成像系統(tǒng)：法國Vilber Lourmat公司；TMS-PRO物質(zhì)分析儀：北京盈盛恒泰科技有限責任公司；FA-25高速組織勻漿機：上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；IMS-30全自動雪花制冰機：常熟市圣海電器有限公司；NS800分光測色儀：深圳市三恩馳科技有限公司；JYS-A800絞肉機：九陽股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 rBTI的制備與純化

將含pQE30-BTI質(zhì)粒的M15菌接種于LB液體培養(yǎng)基（含 50 μg/mL Kan 和 100 μg/mL Amp），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，加入誘導劑IPTG（終濃度為0.5 mmol/L），誘導4 h后，6 000 r/min離心收集菌體。用緩沖液（Tris-HCl pH 7.5，20 mmol/L）重懸菌體，超聲破碎菌體，在80℃水浴中加熱30 min后，12 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI）粗品。

rBTI的純化采用Ni2+親和層析柱，在液相層析系統(tǒng)上進行。先用緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH7.5）平衡 Ni2+親和柱，將離心后的粗蛋白上樣于Ni2+親和柱，流速設定為1 mL/min，用平衡緩沖液充分洗脫未結(jié)合的雜蛋白后，分別用含80 mmol/L和300 mmol/L咪唑的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH7.5）洗脫親和柱。收集各洗脫峰并進行抑制活性測定及SDS-PAGE分析。

1.2.2 rBTI抑制胰蛋白酶活性的測定

按照Erlanger等的方法[12]，在試管中加入3.2 mL測活緩沖液（pH 8.0，100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2）、50 μL 胰蛋白酶溶液、100 μL rBTI，37 ℃溫浴5 min后，加入17 μL 底物BApNA（0.15 mol/L，溶劑為二甲基亞砜）啟動反應，37℃水浴加熱10 min后加入0.5 mL體積分數(shù)為33%的醋酸終止反應，在410 nm下測定由產(chǎn)物對硝基苯胺產(chǎn)生的吸光值?？瞻捉M加樣順序為先加入0.5 mL 33%的醋酸，后加rBTI。對照組以100 μL的測活緩沖液代替rBTI。胰蛋白酶活力單位定義為410 nm處吸光度值每分鐘內(nèi)增加0.001。抑制1單位胰酶所需抑制劑的量定義為一個抑制活力單位。

rBTI濃度測定按照Jagota的方法進行[13]。以牛血清白蛋白為標準溶液，用Folin-酚法測定蛋白濃度，得到標準曲線線性回歸方程y=0.001x+0.004 2（R2=0.996 1），式中：x為蛋白濃度，mg/mL；y為 410 nm 處吸光度值。測定rBTI反應后的吸光度值，利用標準曲線計算其濃度。

1.2.3 鱸魚魚糜凝膠的制備

將購買的新鮮鱸魚處死并進行預處理，去除魚鱗、魚鰭和魚皮，剔除可見的骨頭。將已處理好的魚肉放在絞肉機中初步斬拌3 min，加入食鹽（2.5%）及rBTI，rBTI濃度梯度為 0 ‰、0.02 ‰、0.04 ‰、0.08 ‰、0.12‰。再次使用高速組織勻漿機（16 000 r/min）進行斬拌后，將鱸魚魚糜灌裝于直徑為2.5 mm的聚乙烯醇管中，1 500 r/min離心20 min，采用二段式加熱法進行處理，即將魚糜于40℃水浴保溫30 min后轉(zhuǎn)入90℃水浴加熱20 min。完成后使用冰水迅速冷卻形成魚糜凝膠，置于4℃保存[14]。

1.2.4 rBTI對魚糜凝膠蒸煮損失率的影響

將斬拌好的魚糜放置在離心管中1 500 r/min離心20 min，記離心后魚糜和聚乙烯醇管的總質(zhì)量為m，同1.2.3采用二段式水浴加熱，制成魚糜凝膠，在4℃下隔夜放置。取出后在室溫25℃下平衡4 h，將管重記為m1，將魚糜凝膠表面水分擦去，記其質(zhì)量為m2，按照公式（1）計算蒸煮損失率[15]。

式中：m為魚肉肉糜與聚乙烯醇管總質(zhì)量，g；m1為管重，g；m2為肉糜凝膠質(zhì)量，g。

1.2.5 rBTI對魚糜凝膠白度的影響

參照Benjakul等[15]的方法將魚肉肉糜凝膠切成厚度為1.5 cm的小塊，使用分光測色儀對魚肉肉糜凝膠進行白度分析。用黑白板對分光測色儀進行校對后，測量魚肉肉糜凝膠的L*（亮度）值、a*（紅色/綠色）值和b*（黃色/藍色）值。每個試驗組取3塊切割后的凝膠進行測量，取平均值，按照公式（2）計算樣品白度值[16]。

式中：L*為亮度值；a*為紅色/綠色值；b*為黃色/藍色值。

1.2.6 rBTI對魚肉肉糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

將魚糜凝膠分切成邊長為1.5 cm的正方體，用TMS-PRO食品物性分析儀對凝膠質(zhì)構(gòu)進行分析。

1.2.6.1 采用針型探頭測定樣品的穿刺力及黏附性

起始力：0.1N；穿刺速度：15mm/s；穿刺距離：5mm；回程速度：30 mm/s；回程距離：8 mm。

1.2.6.2 采用球型探頭測定凝膠硬度

起始力：0.1N；穿刺速度：15mm/s；穿刺距離：5mm；回程速度：30 mm/s；回程距離：8 mm。

1.2.7 rBTI對魚肉肉糜凝膠三氯乙酸-溶解肽的影響

參考Hartree等的方法測定凝膠三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-溶解肽含量[17]。取 1.1 g魚肉肉糜凝膠，加入10 mL剛配制好的三氯乙酸溶液（50 g/L），使用高速組織勻漿機22 000 r/min勻漿5 min后于4℃靜置1 h以溶解可溶性多肽，8 000 r/min離心20 min后，取上清液用Folin-酚法進行多肽含量測定。

1.2.8 rBTI對魚肉肉糜凝膠蛋白的影響

參考Marino等的方法制備肉糜凝膠蛋白樣品[18]。取3.0 g魚糜凝膠，加入27 mL SDS溶液（50 g/L，85℃）。使用勻漿機以16 000 r/min的速度勻漿2 min，在85℃下浸提蛋白1 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液進行SDS-PAGE分析。采用10%的分離膠和4%濃縮膠，濃縮膠和分離膠電壓分別為80 V與100 V。電泳停止后，用考馬斯亮藍染色液染色30 min，換脫色液，直至分離膠背景清晰后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復3次，采用SPSS 17.0進行方法分析和顯著性檢驗，多重比較采用Duncan檢驗，P＜0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 rBTI的制備與純化

rBTI帶有His×6標簽，可以用Ni2+親和柱純化，結(jié)果見圖1。

圖1 rBTI親和層析純化圖譜Fig.1 Affinity chromatography of rBTI

按照1.2.2方法對各蛋白峰抑制活性測定，發(fā)現(xiàn)蛋白峰1和2無抑制活性，而蛋白峰3抑制活性很強，對胰蛋白酶的抑制率達80%，表明穿透峰1和80 mmol/L咪唑洗脫下的均為雜蛋白，300 mmol/L咪唑洗脫下的為目的蛋白。對純化后的rBTI進行了SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見圖2。

圖2 rBTI的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE pattern of rBTI

在SDS-PAGE圖譜上僅出現(xiàn)一個蛋白條帶，表明經(jīng)Ni2+親和柱一步純化，便得到了高純度的rBTI（表觀純度＞95%）。

2.2 rBTI對魚糜凝膠蒸煮損失率的影響

蒸煮損失率是評判肉糜凝膠持水性好壞的重要指標，rBTI對魚糜凝膠蒸煮損失率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著rBTI添加量的增加，凝膠的蒸煮損失率呈逐步下降的趨勢。當rBTI添加量為0.02‰時，魚糜凝膠的蒸煮損失率即發(fā)生了顯著下降（P＜0.05），繼續(xù)增加rBTI添加量至0.04‰，蒸煮損失率雖有下降趨勢，但變化不明顯（P＞0.05）。再繼續(xù)增加rBTI添加量，蒸煮損失率顯著下降（P＜0.05），當添加量為0.12‰時，魚糜凝膠的蒸煮損失率從對照組的3.3%下降至1.68%。以上結(jié)果表明添加rBTI能有效降低魚糜凝膠的蒸煮損失率，提高凝膠的持水性。其原因可能是rBTI改善了魚糜凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使結(jié)構(gòu)變得緊密，從而保留了更多的水分。

圖3 rBTI對魚糜凝膠蒸煮損失率的影響Fig.3 Effect of rBTI on the cooking loss rate of surimi gel

2.3 rBTI對魚糜凝膠白度的影響

rBTI對魚糜凝膠白度的影響見圖4。

小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。圖4 rBTI對魚糜凝膠白度的影響Fig.4 Effect of rBTI on gel whiteness of surimi gel

由圖4可知，改變rBTI添加量對魚糜凝膠的白度值并未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。目前常用于凝膠的添加劑如淀粉、魔芋膠等，在加工過程中易產(chǎn)生褐變，嚴重影響產(chǎn)品白度[19]。本試驗中所用rBTI為純品，而且rBTI對熱穩(wěn)定，在加工過程中不會發(fā)生褐變反應，不會改變凝膠本身的色素累積，能很好地保留魚糜凝膠的白度值。

2.4 rBTI對魚糜凝膠穿刺力的影響

rBTI對魚糜凝膠穿刺力的影響見圖5。

圖5 rBTI對魚糜凝膠穿刺力的影響Fig.5 Effect of rBTI on gel penetration force of surimi gel

由圖5可知，隨著rBTI添加量的增大，魚糜凝膠的穿刺力會逐漸提高。當rBTI添加量為0.02‰時，凝膠的穿刺力較未添加rBTI組有所提高，但并未表現(xiàn)出顯著性差異（P＞0.05）。當rBTI添加量達到0.04‰時，凝膠的穿刺力較未添加rBTI組顯著提高（P＜0.05）。隨著rBTI添加量增加，魚糜凝膠的穿刺力提高，表明rBTI可以提高肉糜凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的緊密度。rBTI添加量為0.04‰、0.08‰以及0.12‰三組之間的穿刺力沒有出現(xiàn)顯著差別（P＞0.05），因此rBTI添加量為0.04‰時即可有效改善魚糜凝膠的穿刺力。

2.5 rBTI對魚糜凝膠黏附性的影響

rBTI對魚糜凝膠黏附性的影響見圖6。

圖6 rBTI對魚糜凝膠黏附性的影響Fig.6 Effect of rBTI on gel adhesion of surimi gel

由圖6可知，隨著rBTI使用量的增大，魚糜凝膠的黏附性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在黏性下降階段，魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定較差，在黏性上升階段，凝膠結(jié)構(gòu)逐步緊密而穩(wěn)定，品質(zhì)得到改善。rBTI添加量在0‰～0.04‰時，魚糜凝膠的黏附性呈下降趨勢。與未添加rBTI組相比，當rBTI含量為0.02‰時，凝膠的黏附性有所降低，但無顯著性差異（P＞0.05），當rBTI添加量為0.04‰時，出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。當rBTI添加量在0‰～0.04‰時，魚糜凝膠的劣化作用大于rBTI對內(nèi)源酶的抑制作用，凝膠的劣化作用為主要優(yōu)勢，劣化使得肉糜凝膠內(nèi)部黏性降低。rBTI添加量在0.04‰～0.12‰時，魚糜凝膠的黏附性呈上升趨勢。rBTI添加量為0.08‰時，凝膠的黏附性雖有提高，但較0.04‰組無顯著性差異（P＞0.05），然而當rBTI添加量提高至0.12‰時，凝膠黏附性較0.04‰組及0.08‰顯著增高（P＜0.05），表明當rBTI添加量大于0.04‰，尤其添加量為0.12‰時，魚糜凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的緊密度顯著提高。因此，隨著rBTI添加量增加，提高了蛋白質(zhì)的黏結(jié)作用，表現(xiàn)為凝膠黏附性增大。

2.6 rBTI對魚糜凝膠強度的影響

rBTI對魚糜凝膠強度的影響見圖7。

圖7 rBTI對魚糜凝膠強度的影響Fig.7 Effect of rBTI on the strength of surimi gel

由圖7可知，當rBTI添加量為0.02‰時，魚糜凝膠強度由1.017 N提高至1.196 N，較未添加rBTI組顯著提高（P＜0.05），表明添加rBTI能夠提高魚糜凝膠的凝膠強度。當rBTI添加量為0.02‰、0.04‰、0.08‰時，凝膠強度有所提高，但差異不顯著（P＞0.05），表明這3組rBTI添加量對魚糜凝膠強度的影響作用相似。研究表明，黃鰭金槍魚魚子中提取的一種胰蛋白酶抑制劑、牛血清蛋白和卵清蛋白均能提高魚糜凝膠的強度[20]。

2.7 rBTI對魚糜凝膠TCA-溶解肽的影響

在肉糜凝膠加工過程中，溫度、內(nèi)源酶等均會引起蛋白質(zhì)降解，尤其在40℃保溫時，降解作用加劇[21]。三氯乙酸（TCA）-溶解肽的含量可以反映肉糜凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)的降解情況，rBTI對魚糜凝膠TCA-溶解肽含量的影響見圖8。

圖8 rBTI對魚糜凝膠TCA-溶解肽含量的影響Fig.8 Effect of rBTI on the content of TCA-dissolved peptide in surimi gel

由圖8可知，TCA-溶解肽含量隨著rBTI添加量的增多呈現(xiàn)下降趨勢，說明添加rBTI可以抑制內(nèi)源酶對魚糜凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)的降解。當rBTI添加量為0.02‰時，凝膠TCA-溶解肽含量較未添加rBTI組下降了 96 μg/mL，差異顯著（P＜0.05），表明 rBTI對魚糜凝膠內(nèi)源酶抑制效果顯著。當rBTI添加量由0.04‰增加至0.12‰時，TCA-溶解肽含量變化不明顯，表明rBTI添加量為0.04‰時對魚糜凝膠內(nèi)源酶的抑制作用已達最大程度。

2.8 魚糜凝膠的SDS-PAGE分析

肌原纖維蛋白是維持肉糜凝膠結(jié)構(gòu)的主要蛋白質(zhì)，如肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC，分子質(zhì)量為200 kDa）及肌動蛋白（actin，分子質(zhì)量為43 kDa）等對凝膠的形成及穩(wěn)定有重要影響。對魚糜凝膠蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖9。

圖9 不同rBTI添加量魚糜凝膠蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.9 SDS-PAGE pattern of surimi gel added with rBTI at different levels

隨著rBTI添加量的增多，魚糜凝膠中的肌球蛋白重鏈以及肌動蛋白明顯增多。SDS-PAGE結(jié)果與TCA-溶解肽結(jié)果一致，添加rBTI抑制了魚肉肉糜中內(nèi)源酶的活性，減弱了酶對肌肉纖維蛋白的水解，TCA-溶解肽含量較對照組降低。同時，更多肌肉纖維蛋白的保留有利于魚糜凝膠的形成及維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，凝膠穿刺力及強度等指標較對照組顯著提高。

3 結(jié)論

本試驗通過誘導表達及親和層析獲得了高純度的rBTI，檢測了rBTI對魚糜凝膠蒸煮損失率、白度、穿刺力、黏附性及凝膠強度的影響，并對其作用機理進行了初步探索。結(jié)果表明，rBTI對魚糜凝膠的白度無顯著影響，可以有效降低蒸煮損失率，提高保水性，并改善凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。綜合白度值、穿刺力、強度、TCA-溶解肽含量等指標，得出rBTI為0.04‰是最適合的添加量。通過TCA-溶解肽含量測定及SDSPAGE試驗，分析rBTI通過抑制內(nèi)源酶對肌球蛋白的降解從而維持魚肉肉糜凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。魚糜在70℃保溫時易形成劣化凝膠，嚴重降低凝膠品質(zhì)。rBTI有極好的耐熱性，對類胰蛋白酶有較強的抑制作用，今后可進一步研究rBTI對凝膠劣化的抑制作用及條件。

傳統(tǒng)營養(yǎng)理論認為蛋白酶抑制劑是抗營養(yǎng)因子，有關(guān)蛋白酶抑制劑的報道多集中于對其滅活方法的研究[22]。然而，如今膳食中蛋白質(zhì)普遍過剩，少量抑制劑引起的營養(yǎng)素吸收降低并不會妨礙人體健康，迄今為止還未有研究證明少量的蛋白酶抑制劑對人體有害。越來越多的報道表明蛋白酶抑制劑是膳食中重要的活性成分[23]。本文研究蛋白酶抑制劑對肉糜凝膠的影響及機理，拓寬了蛋白酶抑制劑的應用渠道，為鱸魚魚糜制品的開發(fā)提供了新的思路。