三七黃芪顆粒中丹參素含量測(cè)定方法研究

湖南省衡陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院（421001）劉琪

健康元藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司（518000）劉娟 曾菊香 成燁

近年來(lái)有關(guān)丹參素含量測(cè)定方法研究較少，尤其是制劑中丹參素的含量測(cè)定。本方法選用高效液相色譜法，通過(guò)參考文獻(xiàn)[1][2][3]，對(duì)三七黃芪顆粒丹參素含量測(cè)定方法中的色譜條件、提取溶劑、提取時(shí)間、溶劑體積等進(jìn)行考察，篩選最優(yōu)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行分析方法驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（配備二級(jí)陣列管檢測(cè)器）、超聲波清洗器、梅特勒-托利多XSE 205電子分析天平。

1.2 試劑和試藥 丹參素鈉對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：110855-201614），三七黃芪顆粒（批號(hào)：20180501）、甲醇（分析純、色譜純）、乙酸（36%）、高純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：YMC Triart C18（4.6mm×250mm，5um）高效液相色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-1%乙酸（10∶90）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；進(jìn)樣量：10uL；理論塔板數(shù)按丹參素計(jì)應(yīng)不低于3000。

1.3.2 丹參素對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對(duì)照品適量，加甲醇配制成0.1mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液加水配制成0.04mg/mL的溶液，即得。

1.3.3 供試品溶液的制備 取三七黃芪顆粒適量，研細(xì)，精密稱取1.0g，至25mL棕色容量瓶中。加水適量使完全溶解，并定容至刻度，搖勻，用0.45um濾膜濾過(guò)，即得。

1.3.4 陰性溶液的制備 按產(chǎn)品配方除丹參以外的其他成分，按三七黃芪顆粒制得丹參陰性樣品溶液。取陰性提取液2mL，按1.3.3供試品配制方法配制陰性溶液。

2 方法學(xué)考察[4]

2.1 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、丹參陰性樣品溶液、供試品溶液按1.3.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果在供試品溶液色譜圖中，存在于與丹參素鈉對(duì)照品溶液色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，且陰性溶液在相同保留時(shí)間位置未出現(xiàn)色譜峰，表明本方法專屬性好，陰性樣品沒(méi)有干擾。供試品中，丹參素與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論板數(shù)按丹參素計(jì)符合要求。見(jiàn)附圖。

附表 準(zhǔn)確度（回收率）試驗(yàn)結(jié)果

附圖 HPLC色譜圖，A：對(duì)照品溶液；B：丹參陰性溶液；C：供試品溶液

2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取丹參素鈉對(duì)照品溶液10uL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。峰面積RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0，4，8，12，16h時(shí)，分別吸取10uL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積RSD為0.5%，表明供試品溶液在16小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，表明該方法的穩(wěn)定性較好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批三七黃芪顆粒樣品，精密稱取5份，依上述方法測(cè)定丹參素含量，含量RSD為1.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 線性考察 分別取精密吸取丹參素鈉對(duì)照品溶液2μl、5μl、10μl、15μl、20μl（相當(dāng)于丹參素0.0793μg、0.1984μg、0.3967μg、0.5951μg、0.7934μg）注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積。以峰面積A對(duì)含量C進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y=750.96x+3.5891（r=0.999，n=5）。結(jié)果表明，丹參素在0.0793～0.7934ug范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.6 準(zhǔn)確度（回收率）試驗(yàn) 精密稱取已知含量的本品（批號(hào)：20180501，含量為149.2mg/100g）1.0g，加水適量使溶解，加入對(duì)照品儲(chǔ)備液8mL，混勻，按“供試品溶液的制備方法”配制。同法操作6份，結(jié)果詳見(jiàn)附表。

2.7 耐用性 分別選擇不同色譜柱（①YMC Triart C18；②GL Sciences Inc. Inertsil ODS-3）、不同柱溫（25℃、30℃、35℃），對(duì)丹參素的保留時(shí)間、分離度及理論板數(shù)進(jìn)行考察?？疾旖Y(jié)果表明，不同色譜柱，不同柱溫條件下，丹參素主峰的保留時(shí)間、分離度和理論板數(shù)有所差別，但均符合系統(tǒng)適用性要求。說(shuō)明本方法耐用性較好。

2.8 含量測(cè)定 取3批供試品，按1.3.3方法操作制備供試品溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算供試品含量，結(jié)果批號(hào)20180501的含量為147.2mg/100g，批號(hào)20180502的含量為146.5mg/100g，批號(hào)20180502的含量為151.1mg/100g。

3 結(jié)論

本法用于測(cè)定三七黃芪顆粒中的丹參素鈉，精密度高，準(zhǔn)確度好，方法穩(wěn)定，且良好的保留時(shí)間使丹參素與雜質(zhì)徹底分離，達(dá)到分離度要求，測(cè)定結(jié)果可靠，可作為丹參素鈉的含量測(cè)定的有效方法。

4 討論

4.1 對(duì)照品溶液配制方法的考察 丹參素對(duì)照品溶液使用甲醇作為溶劑時(shí)，色譜峰會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的前延使峰形不對(duì)稱。而改用水配制后峰前延消失。但用水配制對(duì)照品溶液不利于保存，最終，丹參素對(duì)照品溶液采用二步稀釋的方法，先用甲醇配制成對(duì)照品儲(chǔ)備液，再用水稀釋后進(jìn)樣。最終，峰前延現(xiàn)象得以解決。

4.2 流動(dòng)相的選擇 丹參素屬于有機(jī)酸類，流動(dòng)相中酸度的大小對(duì)丹參素的保留時(shí)間及峰形均有影響。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了甲醇-1%乙酸（10∶90）[1]、甲醇-0.2%冰醋酸（1∶5）[2]、甲醇-0.5%冰醋酸（16.7∶83.3）[3]進(jìn)行考察。結(jié)果表明，甲醇-1%乙酸（10∶90）為流動(dòng)相可將丹參素與其他組分分離，且峰形對(duì)稱，保留時(shí)間合理，系統(tǒng)適用性均能達(dá)到要求。

4.3 提取溶劑的選擇 丹參素的解離與酸度有關(guān)，而供試品中雜質(zhì)的溶出量與甲醇的濃度有關(guān)，因此，分別考察以水、1%乙酸、甲醇、50%甲醇、甲醇-1%乙酸（1∶1）為供試品的提取溶劑，考察最佳提取溶劑?？疾旖Y(jié)果表明，雜質(zhì)方面，水、1%乙酸雜質(zhì)情況接近，最大峰高小于60；甲醇、50%甲醇、甲醇-1%乙酸（1∶1）雜質(zhì)情況接近，最大峰高大約在150，各溶劑的雜質(zhì)均不干擾丹參素的定量檢測(cè)。含量方面，除使用甲醇作為溶劑處理的樣品含量明顯偏小外，其他各溶劑含量基本一致，基于環(huán)保無(wú)害的原則，選擇水作為本方法的溶劑。

4.4 提取時(shí)間的選擇 由于三七黃芪顆粒的制備過(guò)程添加了輔料，對(duì)主藥進(jìn)行賦形與稀釋，因此可能對(duì)供試品的提取過(guò)程帶來(lái)一定的影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)供試品的前處理采用超聲的形式助溶，考察不超聲、超聲處理10min、20min、30min、40min對(duì)提取效果的影響。結(jié)果表明，供試品超聲與否及超聲時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)含量影響不大，說(shuō)明供試品在水中能快速完全溶解，因此，供試品的處理過(guò)程不需要超聲處理。

4.5 創(chuàng)新點(diǎn) 優(yōu)化了丹參素鈉對(duì)照品溶液的配制方法，解決了對(duì)照品溶液在進(jìn)樣過(guò)程中出現(xiàn)的前沿峰問(wèn)題，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。且在本文研究中，采用了無(wú)毒無(wú)害的水作為提取溶劑，通過(guò)考證流動(dòng)相的酸濃度，調(diào)整目標(biāo)峰的保留時(shí)間，使之與相鄰峰之間的分離度符合要求，為三七黃芪顆粒的質(zhì)量控制提供很好的參考作用。