宮頸癌組織中miRNA-21表達(dá)與其發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系

張小燕 黃 娟 李曉麗

宮頸癌在高危型HPV病毒感染的人群中，具有較高發(fā)病率。在不同的內(nèi)外環(huán)境誘導(dǎo)下，宮頸柱狀上皮細(xì)胞的異常增殖，能夠顯著促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和宮頸癌患者臨床預(yù)后的惡化[1]。在細(xì)胞代謝分子作用水平，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)調(diào)控基因的異常改變，能夠在宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、癌細(xì)胞分化等方面發(fā)揮作用[2]。微小RNA-21(miRNA-21)是微小RNA家族相關(guān)成員，其能夠通過促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，加速腫瘤細(xì)胞核DNA的分裂，調(diào)控上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程，進(jìn)而參與到宮頸上皮細(xì)胞的病變過程[3]。有部分研究者探討了其他微小RNA家族相關(guān)因子的表達(dá)與宮頸癌的關(guān)系，認(rèn)為在宮頸癌患者病灶組織中，存在顯著的微小RNA的表達(dá)波動[4]，但對于miRNA-21的分析不足。本次研究選取收集的87例經(jīng)病理學(xué)檢查確診的宮頸癌組織標(biāo)本，探討了miRNA-21的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征及臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年1月至2016年10月收集的87例經(jīng)病理學(xué)檢查確診的宮頸癌組織標(biāo)本(宮頸癌組)、同期在我院行宮頸檢查確診為宮頸炎的組織標(biāo)本90例(對照組)。

宮頸癌組，患者年齡40～68歲，平均(57.3±7.4)歲，國際婦產(chǎn)聯(lián)盟分期(FIGO)：Ⅰ期20例、Ⅱ期35例、Ⅲ期27例、Ⅳ期5例；腫瘤分化程度：高分化29例、中分化33例、低分化25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性38例；肌層浸潤深度≥1/2 41例、肌層浸潤深度<1/2 46例；腫瘤病灶：≥3.0 cm 47例、<3.0 cm 40例。對照組，患者年齡42～65歲，平均(56.0±9.1)歲。2組患者的年齡比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會制定的標(biāo)準(zhǔn)[5]；②術(shù)前經(jīng)病理學(xué)活檢證實，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實；③患者無放化療、免疫學(xué)治療病史；④本研究符合《赫爾透辛基宣言》相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他部位的惡性腫瘤；②手術(shù)后復(fù)發(fā)的宮頸癌患者；③甲狀腺功能障礙患者；④合并宮頸、生殖系統(tǒng)其他重大疾病的宮頸癌患者。

1.2 實時熒光定量PCR檢測

取100 mg組織置入EP管內(nèi)，加入Trizol進(jìn)行組織溶解，加入0.3 ml氯仿，室溫下震蕩30 s，放置30 min，取上層清亮液體移入另一EP管，加入等體積的異丙嗪溶液，室溫放置30 min，1 000 r/min離心10 min，取沉淀物為RNA，加入75%乙醇溶液1 ml，溶解后1 000 r/min離心10 min，取上清液，加入20 μl DEPC水計算RNA濃度，單位為：μg/μl。采用SuperScript Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen SuperScript Ⅳ反轉(zhuǎn)錄酶 賽默飛公司)進(jìn)行cDNA合成，采用金斯瑞oligo進(jìn)行引物合成和設(shè)計，β-actin作為內(nèi)參，miRNA-21引物上游:CTTTGAGGTGCGTGTTT 下游:CAGTGCTCGCTTAGTGC，設(shè)置3組復(fù)孔，取平均值，CISILE2018高通量PCR儀器購自常州福生生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組和對照組的miRNA-21表達(dá)情況對比

宮頸癌組織中miRNA-21相對表達(dá)量為(4.82±1.62)，顯著高于對照組的(1.40±0.57)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.858,P<0.05)。

2.2 miRNA-21表達(dá)與宮頸癌病理學(xué)特征的關(guān)系

不同F(xiàn)IGO分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及3年不同隨訪結(jié)局的宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-21相對表達(dá)量組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同病灶大小、不同肌層浸潤深度的宮頸癌患者miRNA-21相對表達(dá)量組間比較差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；見表1。

表1 miRNA-21表達(dá)與宮頸癌病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 miRNA-21表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的多因素分析

采用Logistic回歸分析，提示FIGO分期增高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-21相對表達(dá)量升高是宮頸癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)；見表2。

表2 多因素分析結(jié)果

3 討論

宮頸癌的發(fā)生主要考慮與高危型HPV病毒感染導(dǎo)致的宮頸柱狀上皮細(xì)胞異常增殖有關(guān)，在HPV16或者HPV18感染的過程中，宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險可持續(xù)上升[6]。宮頸癌患者放化療后，其遠(yuǎn)期病情進(jìn)展的風(fēng)險仍然較高，遠(yuǎn)期宮頸癌患者臨床病理特征的惡化仍然明顯[7]。部分臨床隨訪觀察研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者的遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險可超過15%以上，5年內(nèi)的病死率可超過18%以上，整體臨床預(yù)后不佳[8]。通過對于宮頸癌患者臨床預(yù)后的評估，能夠在宮頸癌的綜合性診療過程中發(fā)揮作用，從而提高宮頸癌患者臨床預(yù)后的隨訪效果。宮頸鱗狀細(xì)胞癌上皮細(xì)胞抗原能夠在宮頸癌的臨床預(yù)后中發(fā)揮評估作用，但依靠鱗狀上皮細(xì)胞抗原評估宮頸癌臨床預(yù)后的可參考性較低，其對于宮頸癌患者臨床預(yù)后評估的吻合率不足40%[9]。腫瘤基因或者微小RNA相關(guān)因子的波動，能夠在宮頸癌的發(fā)生及中晚期病情進(jìn)展中發(fā)揮作用。而本次研究通過對于宮頸癌患者病灶組織中miRNA-21的表達(dá)分析，能夠為臨床上宮頸癌的診療提供預(yù)后參考指標(biāo)。

miRNA-21作為微小RNA家族相關(guān)成員，其主要表達(dá)于癌細(xì)胞膜周邊及上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞癌基因的錯配修復(fù)過程中，miRNA-21導(dǎo)致的癌基因的激活，能夠顯著提高柱狀上皮細(xì)胞的增殖速度。miRNA-21對于癌細(xì)胞核DNA上游轉(zhuǎn)錄基因的激活，能夠影響到腫瘤細(xì)胞周期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡比例的改變[10-11]。有少部分研究者探討了miRNA-21在宮頸癌患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為在宮頸癌患者病灶組織中，miRNA-21基因轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增水平明顯上升[12-13]，但缺乏對miRNA-21表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系分析。

本次研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者病灶組織中，miRNA-21基因的擴(kuò)增水平明顯高于宮頸良性病變組，統(tǒng)計學(xué)差異明顯，表明miRNA-21在宮頸癌患者病灶組織中存在較高的表達(dá)陽性，之所以存在較高的miRNA-21表達(dá)，主要由于腫瘤細(xì)胞癌基因轉(zhuǎn)錄激活程度的上升，導(dǎo)致了非編碼RNA合成速度的增加。在其他的觀察研究中，也有部分研究者觀察到，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中，miRNA-21基因的表達(dá)陽性率可超過65%以上，在HPV16或者HPV18感染的患者中，miRNA-21基因的擴(kuò)增水平可繼續(xù)上升[14]。本次研究也發(fā)現(xiàn)了miRNA-21的表達(dá)與宮頸癌患者臨床整體性病情的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在FIGO分期較晚或者合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，miRNA-21基因的擴(kuò)增水平較高，表明miRNA-21的擴(kuò)增水平的上升，能夠顯著促進(jìn)宮頸癌患者臨床分期的進(jìn)展，加速盆腔淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移過程。分析其中的原因，主要考慮由于miRNA-21基因擴(kuò)增水平的上升，能夠提高柱狀上皮細(xì)胞內(nèi)腫瘤信號通路蛋白的激活程度，提高了癌細(xì)胞生物學(xué)行為的惡化速度，最終促進(jìn)了腫瘤浸潤范圍的增加，加速了腫瘤細(xì)胞對于淋巴結(jié)內(nèi)皮組織的粘附能力[15]。但在不同浸潤深度或者組織分化程度的患者中，并無發(fā)現(xiàn)miRNA-21的表達(dá)差異，表明miRNA-21的表達(dá)并不會影響到宮頸上皮細(xì)胞的分化成熟過程。在死亡組或者預(yù)后不佳的患者中，miRNA-21基因的擴(kuò)增水平較高，表明miRNA-21能夠影響到宮頸癌患者的臨床預(yù)后。危險關(guān)系分析也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IGO分期增高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-21相對表達(dá)量升高是宮頸癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素，臨床上可以通過檢測miRNA-21基因擴(kuò)增水平，進(jìn)而評估宮頸癌的臨床預(yù)后。

綜上所述，在宮頸癌患者中miRNA-21基因擴(kuò)增水平明顯上升。miRNA-21的上調(diào)還能夠影響到宮頸癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后。