CRISPR-Cas9基因編輯的歷史

我們都知道保持自然界豐富多彩的生物學(xué)基礎(chǔ)是遺傳和變異，遺傳可以讓物種一代一代的穩(wěn)定存在，而變異又可以讓物種變得多姿多彩，使物種內(nèi)的個(gè)體不會一模一樣。而遺傳和變異的基礎(chǔ)是DNA或RNA。DNA的變異可能產(chǎn)生有益基因，也可能會產(chǎn)生有害基因，導(dǎo)致不良性狀的產(chǎn)生。因此生物學(xué)家們一直夢想可以在細(xì)胞內(nèi)對遺傳物質(zhì)或者叫基因進(jìn)行精準(zhǔn)的修改。作為農(nóng)業(yè)科學(xué)工作者或者育種家，當(dāng)需要把某個(gè)優(yōu)良基因?qū)氲皆耘嗥贩N中時(shí)，在基因編輯時(shí)代之前，通常采用的方法是雜交育種、誘變育種等。要把優(yōu)良基因?qū)朐耘嗥贩N，需要育種家一年又一年的田間篩選工作，往往從青年熬到中年，即便如此，能夠培育出較突出的優(yōu)異品種的也是鳳毛麟角。對育種人來說真的太難了。而基因編輯技術(shù)出現(xiàn)后，只需要對目標(biāo)基因進(jìn)行修改，一兩年內(nèi)就可以獲得一系列理想中的品種。

1 基因編輯的定義及基本元素

所謂基因編輯，是指在細(xì)胞內(nèi)對遺傳物質(zhì)進(jìn)行修改。目前常用的基因編輯主要是CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR） and CRISPRassociated(Cas)9）系統(tǒng)，它主要由兩部分組成，一是Cas9蛋白，該蛋白含有核定位信號，可以將表達(dá)的Cas9蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)；另一部分是sgRNA（Single guide RNA），包括5’端20個(gè)堿基的引導(dǎo)RNA和3’端的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，20個(gè)堿基通過序列互補(bǔ)識別目標(biāo)基因，頸環(huán)結(jié)構(gòu)被Cas9識別，二者結(jié)合形成復(fù)合體（圖1）。Cas9蛋白與sgRNA形成復(fù)合體后，可以快速的對基因組內(nèi)的NGG位點(diǎn)（PAM位點(diǎn)）進(jìn)行掃描，一旦找到與引導(dǎo)RNA（20個(gè)堿基）互補(bǔ)的基因組DNA，Cas9/sgRNA復(fù)合體就會停止移動，Cas9蛋白就會對基因組進(jìn)行剪切，在DNA修復(fù)過程中就會產(chǎn)生各種變異，從而達(dá)到對靶標(biāo)基因進(jìn)行編輯的目的[1]。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成單元[1]

2 基因編輯的歷史發(fā)展

基因編輯從誕生起，就對生物領(lǐng)域產(chǎn)生了廣泛的影響，它在疾病治療、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、藥物開發(fā)等多個(gè)方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。在農(nóng)業(yè)上，基因編輯可以極大地推動基因功能研究，而基因功能的清晰明了可以進(jìn)一步促進(jìn)農(nóng)作物的按需改造，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗逆、抗病和環(huán)境友好型的基因編輯農(nóng)作物。

從1987年發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9的第一個(gè)元件開始，到2012年CRISPR/Cas9系統(tǒng)開始應(yīng)用到細(xì)菌中，再到隨后幾年相關(guān)研究的爆發(fā)性增加，我們還在驚嘆它的迅猛勢頭和強(qiáng)大功能之時(shí)，很多相關(guān)技術(shù)卻已經(jīng)成為了歷史。

2.1 間隔重復(fù)回文序列的發(fā)現(xiàn)

1987年，日本的Nakata科研團(tuán)隊(duì)對大腸桿菌iap基因進(jìn)行測序時(shí)，發(fā)現(xiàn)在該基因終止子后存在一串間隔重復(fù)回文序列（圖2），由于可以形成串聯(lián)的二級結(jié)構(gòu)，他們推測該序列可能和mRNA穩(wěn)定有關(guān)[2]。

圖2 基因iap序列中的間隔重復(fù)回文序列[2]

1995年，讀博士的Mojica在幾種古細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的序列（圖3）[3]，他對這種有規(guī)律的序列十分好奇，他推測與細(xì)菌的繁殖有關(guān)。但是重復(fù)序列在基因組中實(shí)在太常見了，沒有多少人在意這些看似沒有功能的序列。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，2000年，Mojica收集了更多的類似序列，他發(fā)現(xiàn)40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌都有這種短的間隔重復(fù)回文序列（圖3）[4]。

圖3 細(xì)菌和古細(xì)菌中的間隔重復(fù)回文序列[3-4]

2.2 Cas基因及CRISPR的由來

2002年，Jansen等發(fā)現(xiàn)，這類間隔重復(fù)回文序列相鄰的區(qū)域，都存在著比較保守的基因(圖4)，這些基因現(xiàn)在統(tǒng)稱為Cas基因[5]。Jansen和Mojica一起命名了CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）和Cas gene（CRISPR-associated gene ）。

圖4 間隔重復(fù)回文序列相鄰的Cas基因[5]

2.3 重復(fù)回文序列之間的間隔序列的來源

2005年，生物學(xué)家Bolotin對間隔重復(fù)回文序列之間的間隔序列產(chǎn)生了興趣，他們把間隔序列與DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，結(jié)果令人十分震驚，原來這些間隔序列大部分來自于噬菌體。學(xué)者M(jìn)ojica也發(fā)現(xiàn)這些序列來自于噬菌體或質(zhì)粒，他們都推測這些間隔序列可能和細(xì)菌防御外來遺傳物質(zhì)侵染有關(guān)[6]。同年，Pource等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這些間隔序列的排列具有一定的規(guī)律性，越是古老的序列，位置離轉(zhuǎn)錄起始越遠(yuǎn)[7]。由此他們提出CRISPR可能參與細(xì)菌的免疫功能的假說。

2.4 CRISPR系統(tǒng)與細(xì)菌的免疫

2007年，Horvath課題組的Barrangou博士首次證明了CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)：當(dāng)噬菌體侵染細(xì)菌時(shí)，在細(xì)菌的CRISPR處獲得了新的來源于噬菌體的間隔序列，同時(shí)新的菌株能對噬菌體產(chǎn)生抗性；另外，Cas基因的突變使細(xì)菌喪失了抗性（圖5）[8]。

圖5 CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)[8]

2.5 外源DNA的剪切

既然CRISPR系統(tǒng)與細(xì)菌的免疫系統(tǒng)有關(guān)，當(dāng)噬菌體入侵細(xì)菌遺傳系統(tǒng)后，細(xì)菌就會對外源DNA進(jìn)行剪切，從而產(chǎn)生抗性。2008年，Deveau等發(fā)現(xiàn)了Cas蛋白剪切位點(diǎn)（PAM位點(diǎn)）具有保守性[9]。2011年，Charpentier教授剛工作不久，也對這類系統(tǒng)產(chǎn)生了十分濃厚的興趣，她找了個(gè)碩士研究生Deltcheva進(jìn)行相關(guān)研究，他們發(fā)現(xiàn)一段非編碼RNA介導(dǎo)了DNA的剪切（圖6）[10]，研究結(jié)果發(fā)表在頂尖級學(xué)術(shù)雜志Nature上。

圖6 非編碼RNA介導(dǎo)DNA的剪切[10]

2.6 CRISPR/Cas作為細(xì)菌的免疫防御系統(tǒng)的作用機(jī)制

至此，CRISPR/Cas作為細(xì)菌的免疫防御系統(tǒng)的作用機(jī)制已大致清晰：當(dāng)外來DNA入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR/Cas可以捕獲外來DNA片段到CRISPR的間隔區(qū)，該序列表達(dá)后與tracRNA互補(bǔ)與Cas9結(jié)合形成復(fù)合體，從而對外來DNA進(jìn)行剪切(圖7)[11]。同樣，作為基因編輯系統(tǒng)的幾個(gè)重要要素都已清晰，包括Cas9蛋白，sgRNA，PAM位點(diǎn)，tracRNA等[12]。

2012年9月，Siksnys首次在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)Cas9和RNAs，實(shí)現(xiàn)了對細(xì)菌基因組DNA的剪切（圖8）[13]。2012年4月6日Siksnys將手稿投遞給Cell雜志，6天后該雜志通知其拒稿。Virginijus Siksnys于當(dāng)年5月21日將該稿投給PNAS雜志并于9月4日在線發(fā)表。

圖7 CRISPR/Cas9作為細(xì)菌的免疫防御系統(tǒng)的作用機(jī)制[11-12]

圖8 細(xì)菌內(nèi)表達(dá)Cas9和RNAs實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌基因組DNA的剪切[13]

同年7月，來自加州大學(xué)伯克利分校的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）和瑞典于默奧大學(xué)的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）合作將tracRNA和crRNA整合成一條RNA，并發(fā)現(xiàn)只需Cas9和人工sgRNA在細(xì)菌內(nèi)就能對DNA進(jìn)行剪切（圖9）[14]。2012年6月8日將論文投與Science雜志，并于6月28日發(fā)表。她們的研究證明了在雙鏈RNA指導(dǎo)下切割雙鏈DNA斷裂的內(nèi)切酶家族并揭示了CRISPR/Cas系統(tǒng)在RNA指導(dǎo)下進(jìn)行基因編輯的巨大潛力。

2.7 CRISPR系統(tǒng)在動植物中編輯功能的實(shí)現(xiàn)

2013年2月，Science背靠背發(fā)表了麻省理工學(xué)院博德研究所的張鋒課題組和來自于哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的George Church課題組關(guān)于CRISPR系統(tǒng)在動物細(xì)胞系中的編輯功能(圖10）[15-16]。加州大學(xué)舊金山分校系統(tǒng)及合成生物學(xué)中心的華人齊磊（Lei S.Qi）實(shí)驗(yàn)室，同年也成功將CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用到哺乳動物細(xì)胞中，研究結(jié)果發(fā)表在Cell雜志上[17]。隨后，人們實(shí)現(xiàn)了對果蠅、線蟲、大鼠、豬、羊、等多種動物的基因編輯。同時(shí)，基因編輯技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如癌癥治療，胚胎編輯，干細(xì)胞等方面的應(yīng)用在中美兩國像展開競賽一樣，只要有人通過創(chuàng)新領(lǐng)先一步，其他人就會奮起直追。

圖9 Cas9和人工sgRNA在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌DNA的剪切[14]

圖10 CRISPR系統(tǒng)在動物細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)基因編輯[15-16]

同年，在植物中也有了相關(guān)報(bào)道。其中中國科學(xué)院遺傳所的高彩霞老師開發(fā)了多種基因編輯工具，用于植物的基因編輯，極大地推動了植物的基因編輯的發(fā)展[18-19]。且高彩霞老師課題組創(chuàng)建了首個(gè)具有應(yīng)用價(jià)值的基因編輯農(nóng)作物，抗白粉病的面包小麥(圖11)[20]。

圖11 基因編輯的抗白粉病面包小麥的創(chuàng)制[20]

2.8 基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用及監(jiān)管

基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用也展露頭角。除了上面提到的基因編輯的抗白粉病小麥，還有像花束一樣的基因編輯西紅柿，美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室通過對控制株型緊湊快速開花的基因SP5G和終止生長，提前成熟的基因SP進(jìn)行基因編輯，創(chuàng)制出早花早熟，果實(shí)成束，顏色多彩的城市西紅柿（圖12）[21]。日本的筑波大學(xué)通過對花青素合成酶基因DFR-B進(jìn)行基因編輯和修飾，得到了色彩斑斕的牽牛花（圖12）[22]。而賓夕法尼亞大學(xué)的白蘑菇也只是對一個(gè)多酚氧化酶基因PPO進(jìn)行了編輯就實(shí)現(xiàn)了多酚氧化酶活性降低30%，從而減少了白蘑菇在空氣中的褐化（圖12）。而且，據(jù)nature news報(bào)道這種基因編輯蘑菇已經(jīng)不在美國農(nóng)業(yè)部監(jiān)管范圍內(nèi)[23]。歐洲對轉(zhuǎn)基因比較保守，甚至影響了基因編輯作物的發(fā)展。數(shù)據(jù)顯示，從2007年到2011年，35%的基因編輯的科學(xué)出版來自歐洲，但之后被美國超過。也有科學(xué)家呼吁歐盟放松作物基因組編輯監(jiān)管[24]。中國雖然在研究水平上處于世界領(lǐng)先地位，但由于公眾輿論壓力大，即便是基因編輯領(lǐng)域的專家也是小心謹(jǐn)慎，我們也只能從一些學(xué)術(shù)會議上聽到科學(xué)家們呼吁我國應(yīng)該放松對基因編輯作物的監(jiān)管的“建議”。

短短幾年時(shí)間，基因編輯系統(tǒng)深刻的改變了生命科學(xué)研究。當(dāng)我們還在驚嘆于系統(tǒng)內(nèi)某項(xiàng)新技術(shù)功能強(qiáng)大之時(shí)，它已經(jīng)被更絕妙的方法所替代，而上一項(xiàng)技術(shù)已然成為了歷史?；蚓庉嫾夹g(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用以及由此而產(chǎn)生的基因編輯產(chǎn)品也是讓人目不暇接，似乎只有如何監(jiān)管已經(jīng)成為了一個(gè)被追著跑的問題。

圖12 基因編輯西紅柿，蘑菇和牽?；╗21-23]