高效液相色譜法測定藍(lán)莓酵素酒中山梨酸和糖精鈉含量的不確定度評定

周楠 丁紅梅 楊俊

[摘要]依據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）及《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）中不確定度評定的一般流程，對高效液相色譜法測定藍(lán)莓酵素酒中山梨酸和糖精鈉含量測量不確定度進(jìn)行評定。通過建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，分析高效液相色譜法測定藍(lán)莓酵素酒中山梨酸和糖精鈉含量測量中引入的各測量不確定度分量，計算得到測量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。當(dāng)置信度為95%，包含因子為2時，得到測量結(jié)果山梨酸擴(kuò)展不確定度為0.007 6g/kg，樣品中山梨酸含量表示為（0.169 5±0.007 6）g/kg;糖精鈉擴(kuò)展不確定度為0.004 9g/kg，含量測定結(jié)果可表示為（0.138 0±0.004 9）g/kg。評定結(jié)果表明，影響檢測結(jié)果不確定度的因素主要是標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制和儀器重復(fù)測定。本方法對高效液相色譜法測定藍(lán)莓酒中山梨酸和糖精鈉含量結(jié)果的不確定度評定具有參考作用。

[關(guān)鍵詞]不確定度;山梨酸;糖精鈉;高效液相色譜法;藍(lán)莓酵素酒

中圖分類號：TS275.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202008

食品添加劑作為現(xiàn)代食品工業(yè)重要組成部分，對于改善食品色、香、味、形，提高食品的質(zhì)量和檔次，防止腐敗變質(zhì)發(fā)揮著重要的作用[1]。但食品添加劑在食品加工環(huán)節(jié)超限量或者違規(guī)使用會對人體健康造成潛在危害[2]。山梨酸是一種國際公認(rèn)安全的防腐劑，安全性很高，但如果山梨酸的添加量超標(biāo)，消費(fèi)者長期食用，在一定程度上會抑制骨骼生長，危害腎、肝臟的健康[3]。糖精鈉作為甜味劑甜度約為蔗糖的450～550倍，食用較多后，會影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使食欲減退，有致癌和致遺傳損害的可能性[4-5]。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定山梨酸及其鉀鹽與糖精鈉在配制酒的最大允許使用量分別為0.4g/kg、0.15g/kg[6]。2011年中國合格評定國家認(rèn)可委員會頒布的《測量不確定度的要求》（CNAS-CL07）指出：當(dāng)不確定度與檢測結(jié)果的有效性或應(yīng)用有關(guān)、或在用戶有要求時、或當(dāng)不確定度影響到對規(guī)范限度的符合性時、當(dāng)測試方法中有規(guī)定時和CNAS有要求時，檢測報告必須提供測量結(jié)果的不確定度。故測量不確定度的評定對實驗室檢測的準(zhǔn)確表示和評定具有重要意義[7]。本文參照《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[8]及《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]，建立測量模型，對其進(jìn)行不確定度來源分析和評定，為同類項目的測定結(jié)果的不確定度評定及分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藍(lán)莓酵素酒：市售;乙酸銨：分析純，國藥集團(tuán)有限公司;甲醇：色譜純，德國Merck公司;山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 110-44-1，純度99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司;糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 128-44-9，純度99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司;高效液相色譜儀：Agilent 1260，安捷倫科技（中國）有限公司;電子天平：BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;離心機(jī)：eppendorf 5430，德國艾本德股份公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取約2g（精確到0.001g）試樣于50mL具塞離心管中，加水約25mL，渦旋混勻，于8 000r/min離心5min，將水相轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，于殘渣中加水20mL，渦旋混勻后超聲5min，于8 000r/min離心5min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22μm濾膜，待液相色譜測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別準(zhǔn)確移取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品（1 000μg/mL）和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品（1 000μg/mL）各1.0mL于10mL容量瓶中配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/mL）。逐步稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度分別為1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Shiseido Solar C18柱（150mm×4.6mm，0.5μm）;流動相：0.02mol/L 乙酸銨溶液-甲醇（95∶5，v/v）;流速：1mL/min;進(jìn)樣量：10μL。

2 不確定度評定

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

山梨酸、糖精鈉的含量計算公式：

X=（c×v）÷（m×1 000） ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1）

式中：X為試樣中待測組分含量，g/kg;c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣液中待測物的質(zhì)量濃度，mg/L;v為試樣定容體積，mL;m為試樣質(zhì)量，g。1 000是由mg/kg轉(zhuǎn)換為g/kg的換算因子。

2.2 不確定度主要來源及分析

分析測定的整個過程和數(shù)學(xué)模型，不確定度主要來源如下：

（1）稱量樣品質(zhì)量產(chǎn)生的不確定度u（m），主要包括天平校準(zhǔn)引入u1（m）、樣品重復(fù)稱量引入不確定度u2（m）。（2）樣品處理液定容體積產(chǎn)生的不確定度u（v），主要包括溫度變化引入不確定度u1（v）、容量瓶檢定引入的不確定度u2（v）。（3）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線產(chǎn)生的不確定度u（c）：①標(biāo)準(zhǔn)溶液制備產(chǎn)生的不確定度u1（c），包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度u2（c）、量器引入不確定度u3（c），u3（c）又包括量器校準(zhǔn)引入的不確定度u4（c）和溫度變化引入的不確定度和u5（c）;②曲線擬合產(chǎn)生的不確定度u6（c）。（4）儀器重復(fù)測量樣品產(chǎn)生的不確定度u（f），包括儀器校準(zhǔn)引入的不確定度u1（f）和重復(fù)測量引入的不確定度u2（f）。

由于以上各不確定度分量互不相關(guān)，所以其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：

urel（X）=[urel（m）2+urel（v）2+urel（c）2+urel（f）2] ? ? ? ?（2）

3 各分量標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

3.1 稱量樣品引入的不確定度u（m）

3.1.1 由天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度

天平校準(zhǔn)證書上允許的極差為±0.1mg，按照均勻分布考慮，包含因子k=3，因此計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1（m）=0.1÷3 =5.77×10-2mg。

稱量需進(jìn)行二次（一次清除稱量容器質(zhì)量，一次稱量樣品質(zhì)量），則二次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1（m）=[2×（0.1÷3 ?）2 ] ?=0.081 65mg，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1rel（m）=U1（m）÷m=0.081 65÷（2.011 0× 1 000）=4.060 2×10-5。

3.1.2 重復(fù)稱量產(chǎn)生的不確定度

根據(jù)檢定證書，天平的重復(fù)性誤差為0.2mg，按照均勻分布考慮，包含因子k=3，因此計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（m）=[2×（0.2÷3 ?）2] ?=0.163 30mg，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2rel（m）=U2（m）÷m=0.163 30÷（2.011 0 × 1 000）=8.120 3×10-5。

3.1.3 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度

天平稱量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）=[u1rel（m）2+u2rel（m）2] =[（4.060 2×10-5）2+（8.120 3 × 10-5）2]=9.079×10-5。

3.2 定容樣品引入的不確定度u（v）

3.2.1 溫度變化引入的不確定度

樣品處理液最終定容在50mL容量瓶中，容量瓶在20℃下檢定，當(dāng)實驗室溫度變化為±5℃時，代入水和玻璃的膨脹系數(shù)，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4mL/℃，而玻璃的膨脹系數(shù)為水的膨脹系數(shù)的 ? ，所以忽略不計。按照均勻分布，k=3，則U1（v）=（50×5×2.1×10-4） ÷3 ?=0.030 31mL，u1rel（v）= U1（v）÷v=6.062 4×10-4。

3.2.2 檢定引入的不確定度

根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[10]，A級的50mL單標(biāo)線容量瓶的允差為±0.05mL，按照均勻分布考慮，包含因子k=3，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（v）=0.05÷3=0.028 87mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2rel（v）=U2（v）÷v= 5.774 0×10-4。

3.2.3 由定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（v）=[u1rel（v）2+u2rel（v）2]=[（6.062 4×10-4）2+（5.774 0× 10-4）2] =8.372×10-4。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度u（c）

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度u1（c）包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度u2（c）、量器引入不確定度u3（c），其計算公式如下：

u1rel（c）=[u2rel（c）2+u3rel（c）2] ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （3）

3.3.1.1 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液產(chǎn)生的不確定度

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000μg/mL）和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000μg/mL）證書中提供的擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度為3%和2%，按正態(tài)分布置信概率P=95%，包含因子k=2。使用山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u2rel（山梨酸）=3%÷2=0.015。使用糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u2rel（糖精鈉）=2%÷2=0.01。

3.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋過程中量器引入的不確定度

量器引入不確定度u3（c）包括量器校準(zhǔn)引入的不確定度u4（c）和溫度變化引入的不確定度和u5（c）。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液是由標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋得到，1 000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍得到100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別稀釋5倍、10倍得到20μg/mL和10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋2倍、10倍得到5μg/mL和1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍得到2μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。在稀釋過程中分別使用到1mL單標(biāo)移液管（A級）4次，2mL單標(biāo)移液管（A級）1次，5mL單標(biāo)線容量瓶（A級）1次，10mL單標(biāo)容量瓶6次。

（1）量器校準(zhǔn)引入的不確定度。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[10]1mL、2mL、5mL單標(biāo)移液管及10mL單標(biāo)容量瓶允許誤差分別為±0.007mL、±0.010mL、±0.015mL、±0.02mL，按均勻分布，包含因子k=3，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為u4rel（1mL）=0.007÷（3×1）=4.04×10-3;u4rel（2mL）= 0.010÷（3×2）=2.887×10-3;u4rel（5mL）=0.015÷（3× 5）=1.732×10-3;u4rel（10mL）=0.020 ÷（3×10）= 1.155×10-3。

（2）溫度變化引入的不確定度。校準(zhǔn)過程中室溫變化為（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4mL/℃，按照均勻分布，k=3，則溫度變化引起的不確定度為u5rel（1mL）=（1×5×2.1×10-4）÷（3×1）=6.062×10-4，同理u5rel（2mL）、u5rel（5mL）和u5rel（10mL）均為6.062×10-4。

Urel=urel×k ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （7）

則樣品相對擴(kuò)展不確定度Urel（山梨酸）=0.022 5×2=4.50%，Urel（糖精鈉）=0.017 9×2=3.58%。本樣品中山梨酸含量均值為0.169 5g/kg，糖精鈉含量均值為0.138 0g/kg，因此擴(kuò)展不確定度 U（山梨酸）=0.169 5g/kg×4.50%=0.007 6g/kg，U（糖精鈉）=0.138 0g/kg×3.58%=0.004 9g/kg，故樣品中山梨酸含量最終測定結(jié)果為X（山梨酸）= （0.169 5±0.007 6）g/kg（k=2），糖精鈉含量最終測定結(jié)果為X（糖精鈉）=（0.138 0±0.004 9）g/kg（k=2）。

4 結(jié) 論

根據(jù)國標(biāo)方法測定酒類樣品前處理方法較為簡單，因為樣品均勻程度高，無需沉淀蛋白，基本無不溶性固性物，所以樣品前處理步驟不確定度主要來自樣品的稱量和樣液的定容。通過不確定的評定過程可以得出，稱量和樣液的定容對整個試驗的不確定度影響較小。本試驗主要的不確定度來自標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和儀器重復(fù)測定樣品。其中，影響標(biāo)準(zhǔn)曲線不確定度的主要因素是標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度對標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制不確定度影響較大，實際操作過程中應(yīng)選擇準(zhǔn)確度等級較高的標(biāo)準(zhǔn)品，嚴(yán)格把控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保存溫度、保存環(huán)境，并對開封后保質(zhì)期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行期間核查。同時注重儀器的維護(hù)保養(yǎng)，并定期進(jìn)行儀器期間核查和儀器檢定，保持儀器運(yùn)行的良好狀態(tài)，通過增加平行樣測定次數(shù)，降低測量的不確定度，從而提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少測定結(jié)果的不確定度。

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