日本無(wú)刺花椒抗寒性的初步研究

陳政 李佩洪 唐偉 龔霞 吳銀明 吳軍

摘要：日本無(wú)刺花椒（ZanthoxyJum Japonica）為落葉或小灌木，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的重要調(diào)味品、香料和木本油料樹(shù)種。研究日本無(wú)刺枯椒的抗寒性，為其栽培種植提供依據(jù)。以朝倉(cāng)山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒4個(gè)種類(lèi)花椒（Na）為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行了人工模擬低溫處理，測(cè)定了電解質(zhì)外滲率（REC）、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性、丙二醛含量等抗寒性的生理生化指標(biāo)并進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明：朝倉(cāng)山椒和花山椒抗寒性較強(qiáng)，葡萄山椒抗寒性次之，琉錦山椒抗寒性最弱。

關(guān)鍵詞：日本無(wú)刺花椒;生理生化指標(biāo);抗寒性

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）原產(chǎn)于我國(guó)中西部，為蕓香科花椒屬落葉灌木或小喬木。全世界約有花椒屬植物250種，分布于亞洲、非洲、大洋洲、北美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。中國(guó)是世界花椒第一生產(chǎn)大國(guó)，有39種14變種。四川是我國(guó)花椒主產(chǎn)區(qū)之一，漢源花椒、茂縣大紅袍花椒、金陽(yáng)青花椒、洪雅藤椒、蓬溪青花椒是四川花椒中的五朵金花，是全國(guó)優(yōu)質(zhì)花椒之一。由于花椒樹(shù)干、枝、葉具刺，在育苗、栽植、管理和采收等方面有諸多不便，尤其采收難度大、成本高，花椒采收難是花椒生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，若能以無(wú)刺或少刺花椒品種替代有刺花椒，將會(huì)大幅度提高采收效率、節(jié)約采收成本。為解決生產(chǎn)中花椒刺多的問(wèn)題，我院于2009年從河北林業(yè)科學(xué)研究院引進(jìn)花山椒、朝倉(cāng)山椒、葡萄山椒和琉錦山椒等無(wú)刺花椒品種進(jìn)行引種栽培試驗(yàn)。日本無(wú)刺花椒（Zanthoxylum Japoni-ca），為落葉小灌木，雌雄異株，無(wú)刺或少刺。樹(shù)勢(shì)直立，萌芽力和成枝力均強(qiáng)。雌花具有雌蕊1-3枚;雄花具有雄蕊5-6枚，花粉量大。果實(shí)圓形或橢圓形，油腺點(diǎn)小且密，果皮鮮紅色。果皮、青果、嫩芽、種子等均有重要的應(yīng)用價(jià)值。日本無(wú)刺花椒由于無(wú)刺或少刺，采摘和管理方便，較“茂汶花椒”“漢源花椒”“九葉青花椒”“藤椒”等花椒品種節(jié)約大量采摘用工和管理用工。日本無(wú)刺花椒在引種、育苗、栽培機(jī)理、修剪技術(shù)、施肥技術(shù)、風(fēng)味物質(zhì)及離體愈傷組織等方面做了大量工作，但對(duì)無(wú)刺花椒抗寒性研究報(bào)道較少，畢君對(duì)1a生枝條的細(xì)胞膜透性和SOD活性變化、POD活性變化、MDA含量變化、自然越冬的枝條電導(dǎo)率與凍害3種途徑進(jìn)行抗寒評(píng)價(jià)，而紅花椒抗寒性研究報(bào)道較多。為此，筆者對(duì)無(wú)刺花椒材料的抗寒性進(jìn)行初步研究?；ń房购匝芯颗c農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)。解決花椒寒害的途徑很多，其中選用耐寒的優(yōu)良花椒品種是最經(jīng)濟(jì)、也是最有效的途徑之一。因此，探索花椒抗寒性生理機(jī)制，不僅在理論上有重要意義，而且在生產(chǎn)中也具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。

1試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在四川省資中縣明心寺鎮(zhèn)，位于29°44.29N，104°56.38E，年均氣溫17.4℃，極端最低氣溫-3.2℃：，極端最高氣溫41.9℃，年均日照時(shí)數(shù)1246.5h，年均降雨量1007.7mm，降雨量主要分布在5-9月。土壤為砂壤土，pH值7.0.海拔310m。

1.2試驗(yàn)材料

測(cè)定的材料有朝倉(cāng)山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒，共4個(gè)品種，樹(shù)齡為2a。

1.2.1朝倉(cāng)山椒。枝條密集，成抱頭狀生長(zhǎng)，新梢上部綠色下部為棕色;樹(shù)皮光滑，基本無(wú)刺;葉片長(zhǎng)寬均值為20.66mm/9.62mm，葉緣為鋸齒狀，向內(nèi)卷曲，小葉數(shù)多為11-15枚;果實(shí)圓形，果實(shí)縱橫徑均值為4.85mm/4.46mm，臍部有一小突起，有殘留花柱，果皮鮮紅色。油腺點(diǎn)小、密而深陷?；ㄆ跒?月中下旬，果期為8月中下旬。

1.2.2葡萄山椒。枝條較疏張，生長(zhǎng)勢(shì)較弱;有皮刺;新梢上部綠色，下部為棕色;葉片長(zhǎng)寬均值為24.66mm/12.28mm，葉緣為鋸齒狀，向內(nèi)卷曲，小葉數(shù)多為9-P7枚;果實(shí)較大，果實(shí)縱橫徑均值為6.45mm/5.07mm，臍部有一小突起，有殘留花柱，果皮鮮紅色。油腺點(diǎn)小且密而深陷，花期為3月中下旬，果期為8月中下旬。

1.2.3琉璟山椒。樹(shù)姿較舒張，生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng);無(wú)刺;新梢上部綠色，下部為棕色;

葉片長(zhǎng)寬均值為21.27mm/10.17mm，葉緣為鋸齒狀，葉片平整，小葉數(shù)多9-15枚;果實(shí)較大，圓形，縱橫徑均值為5.94mm/5.01mm，臍部有一小突起，有殘留花柱，果皮鮮紅色。油腺點(diǎn)小、密而深陷。花期3月中下旬，果期為8月下旬-9月上旬。

1.2.4花山椒。樹(shù)勢(shì)強(qiáng)，枝條粗壯;無(wú)刺;葉片長(zhǎng)寬均值為25.67mm/12.26mm，葉緣為鋸齒狀，向內(nèi)卷曲，小葉數(shù)多為13-15枚;成花容易且花粉量極大，是比較理想的授粉品種?；ㄆ跒?月上中旬。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1植物材料處理。2019年4月，取樣時(shí)間為上午7：00-9：00.剪取健康、無(wú)病蟲(chóng)害的朝倉(cāng)山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒花椒幼樹(shù)樹(shù)冠中部外側(cè)的4個(gè)方位的夏梢頂部向下的第4葉、第5葉（完整葉），將葉片用潔凈的濕紗布擦拭并晾干，按品種、處理分裝于塑料袋中，放人冰箱內(nèi)進(jìn)行人工冷凍，處理溫度分別為-6、-4、-2、0、2和4℃并保持恒溫5h。隨后，將各處理葉片放人-20%超低溫冰箱中保存，用于測(cè)定SOD活性、POD活性、MDA含量生理指標(biāo)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2019年1月上旬在資中試驗(yàn)地內(nèi)，選取朝倉(cāng)山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒4種花椒的健康、無(wú)病蟲(chóng)害的1a生枝條作為供試材料。將各花椒的枝條用潔凈的濕紗布擦拭并晾干，放人冰箱內(nèi)從0℃開(kāi)始降溫，降溫速率為4℃/h，處理溫度分別為：-4、-8、-12、-16、-20、-24、-28℃，并保掙叵溫12h。再以同樣的速率升溫至0℃，取出枝條用于REC的測(cè)定，以放置室溫下（約為0℃）的枝條為對(duì)照（CK），設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.2指標(biāo)測(cè)定方法。過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶（sOD）活性測(cè)定采用NBT（氮藍(lán)四唑）光化還原法，丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，電解質(zhì)外滲率采用電導(dǎo)率法。數(shù)據(jù)取各生理指標(biāo)3次測(cè)定結(jié)果的平均值。以上測(cè)定方法均參考文獻(xiàn)。

1.3.3數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)處理用EXCEL和DPS（v6.85版）軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1SOD酶活性的變化

在正常條件下，植物細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)，這樣可以保持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，維持正常的生理代謝活動(dòng)。當(dāng)植物處于各種逆境脅迫時(shí)，這種平衡會(huì)受到破壞而出現(xiàn)自由基的累積，從而引發(fā)或加劇細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用，造成膜系統(tǒng)受損，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在低溫逆境條件下，SOD能被活性氧誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而減輕對(duì)細(xì)胞膜的傷害。SOD、POD是植物體內(nèi)清除自由基的主要酶類(lèi)，其活性大小反映細(xì)胞對(duì)逆境的適應(yīng)能力，也間接表明植物耐寒性的強(qiáng)弱。

植物在低溫脅迫初期，在植物細(xì)胞內(nèi)，SOD主要起清除超氧自由基的作用。圖1所示，各花椒SOD活性隨著低溫脅迫的加強(qiáng)顯示出了先下降后增加的變化趨勢(shì)。隨著低溫的加深，4個(gè)山椒品系都是從4℃降到0℃時(shí)SOD活性下降，從0℃降到-6℃時(shí)上升，SOD活性變化呈“V”趨勢(shì)。SOD活性上升速率并不均勻，在0℃降到-2℃時(shí)SOD活性上升較快，其中葡萄山椒SOD活性上升最快，琉錦山椒次之，朝倉(cāng)山椒SOD活性上升最慢?；ㄉ浇稴OD活性的變化趨勢(shì)不同，花山椒4℃降到-2℃時(shí)SOD活性下降，從-2℃降到-6℃時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，活性變化呈“v”趨勢(shì)?？梢?jiàn)，從SOD活性上升速率來(lái)看，葡萄山椒的上升速率最快，琉錦山椒的較快，朝倉(cāng)山椒的次之，花山椒的最慢。

2.2POD酶活性的變化

過(guò)氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)普遍存在的活性較高的一種酶，它能夠清除超氧自由基形成H₂O₂，從而保護(hù)植物免受活性氧傷害。圖2所示，4個(gè)山椒品系POD活性隨著低溫脅迫的加強(qiáng)顯示出了花山椒先下降后增加后又下降再增加的變化趨勢(shì)。隨著低溫的加深，都是從4℃降到2℃時(shí)POD活性下降，從2℃降到0℃時(shí)上升，0℃降到-2℃時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，從-2℃降到-6℃時(shí)又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，活性變化呈“W”趨勢(shì)。朝倉(cāng)山椒、琉錦山椒和葡萄山椒從4℃降到-2℃時(shí)下降，從-2℃降到-6℃時(shí)上升，活性變化呈“v”趨勢(shì)，POD活性上升速率不均勻，4個(gè)山椒品系在-2℃降到-4℃時(shí)上升較慢，在-4℃降到-6℃時(shí)上升較快，葡萄山椒POD活性上升速率最快?？梢?jiàn)，從POD活性上升速率來(lái)看，葡萄山椒的最快，花山椒的較快，朝倉(cāng)山椒的次之，琉錦山椒的最慢。

2.3MDA酶含量的變化

植物在逆境條件下往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，其產(chǎn)物MDA會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷生物膜。通常利用它作為膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度及對(duì)逆境反映的強(qiáng)弱，因此在研究植物寒害及抗寒性時(shí)，測(cè)定MDA含量的變化可作為一項(xiàng)生理鑒定指標(biāo)。從圖3可知，4個(gè)山椒品系MDA含量隨著低溫脅迫的加強(qiáng)大多顯示出先下降后上升的趨勢(shì)。各山椒品系MDA含量上升溫度不同，增幅也不同。花山椒MDA含量從2℃開(kāi)始上升，2℃降到0℃時(shí)其MDA含量上升了0.926umol/g.FW，隨后增幅變緩;葡萄山椒MDA含量從0℃開(kāi)始上升，0℃降到-2℃時(shí)其MDA含量上升了0.504umol/g.FW，-2℃到-4℃時(shí)MDA含量上升了1.162umol/g.FW，隨后增幅變緩;琉錦山椒MDA含量從-2℃開(kāi)始上升，-2℃降到-4℃時(shí)其MDA含量上升了1.843umol/g.FW，-4℃降到-6℃時(shí)其MDA含量上升了0.754umol/g.FW;朝倉(cāng)山椒MDA含量從-4℃開(kāi)始上升，-4℃降到-6℃時(shí)其MDA含量上升了1.090u-mol/g.FW?？梢?jiàn)，琉錦山椒MDA含量增幅最大，葡萄山椒的次之，朝倉(cāng)山椒的再次之，花山椒的最小。

2.4不同低溫處理對(duì)花椒枝條質(zhì)膜透性的影響

朝倉(cāng)山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒4個(gè)山椒品系1a生枝條經(jīng)低溫處理后，其REC如圖4所示。從圖4可以看出，在一系列冷凍低溫處理下，4種花椒的REC與處理溫度之間關(guān)系呈上升的“s”形曲線。但其REC增加的速率并不均勻，處理溫度越低REC變化相對(duì)越快，且因種類(lèi)而異。當(dāng)溫度高于-16%時(shí)，隨溫度降低，枝條的相對(duì)電導(dǎo)率緩慢上升，-16～-24℃期間，相對(duì)電導(dǎo)率急劇增加，之后趨向平緩。-16℃下降至-20℃時(shí)，4個(gè)山椒品系相對(duì)電導(dǎo)率變化為：琉錦山椒的相對(duì)電導(dǎo)率增幅最大，為19.2%;花山椒的相對(duì)電導(dǎo)率增幅次之，為15.5%;葡萄山椒的為14.3%;朝倉(cāng)山椒的相對(duì)電導(dǎo)率增幅最小，僅為7.9%。相對(duì)電導(dǎo)率急劇增大，說(shuō)明枝條組織已經(jīng)受到嚴(yán)重傷害，膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲。由此可知，在相同低溫下，琉錦山椒電解質(zhì)外滲最多，脂膜損傷程度最重;葡萄山椒與花山椒電解質(zhì)外滲較少，朝倉(cāng)山椒電解質(zhì)外滲最少，脂膜損傷程度較輕，這表明不同花椒種類(lèi)的抗寒性存在差別。

3 結(jié)論與討論

（1）正常情況下，細(xì)胞內(nèi)活性氧與防御系統(tǒng)之間保持著平衡。當(dāng)遭遇低溫時(shí)，活性氧代謝失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧就會(huì)積聚，從而對(duì)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能起破壞作用，這時(shí)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)被誘導(dǎo)和激活，以消除活性氧對(duì)細(xì)胞的損害。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度的下降，SOD和POD和活性呈先下降后升高的變化趨勢(shì)，這與劉玲等在花椒的研究結(jié)果一致，與畢君在山椒的研究結(jié)果存在一定差異，這可能是低溫處理方法不同所致。SOD和POD活性升高，這是4個(gè)山椒枝條對(duì)低溫脅迫所產(chǎn)生的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。

（2）丙二醛含量與植物抗寒性密切相關(guān)，其含量變化可反映植物對(duì)低溫條件反應(yīng)的強(qiáng)弱，抗寒性強(qiáng)的品系枝條含量增幅較小，而抗寒性弱的品系枝條含量增幅較大。本試驗(yàn)中，琉錦山椒MDA含量增幅最大，葡萄山椒的次之，朝倉(cāng)山椒的再次之，花山椒的最小。說(shuō)明琉錦山椒的抗寒性最弱，葡萄山椒的抗寒性較弱，朝倉(cāng)山椒和花山椒的抗寒性較強(qiáng)。

（3）植物遭受低溫脅迫，生物膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，膜透性增大，從而引起電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率的增大。因此，相對(duì)電導(dǎo)率大小能反映細(xì)胞質(zhì)膜的損傷程度。細(xì)胞質(zhì)膜透性大小與植物的抗寒性密切相關(guān)，同樣低溫條件下，細(xì)胞質(zhì)膜透性大，電導(dǎo)率高且上升速度快，表明該植物品種抗寒性差，反之，則抗寒能力強(qiáng)。本試驗(yàn)中，當(dāng)處理溫度降低到-16℃，枝條的相對(duì)電導(dǎo)率出現(xiàn)了一個(gè)快速上升階段，表明枝條受到了嚴(yán)重傷害，細(xì)胞膜透性發(fā)生了不可逆的變化。在-16℃降到-20℃時(shí)，琉錦山椒電解質(zhì)外滲最多，脂膜損傷程度最重;葡萄山椒與花山椒電解質(zhì)外滲較少，朝倉(cāng)山椒電解質(zhì)外滲最少。結(jié)果表明：朝倉(cāng)山椒和花山椒抗寒性較強(qiáng)，葡萄山椒次之，琉錦山椒最弱。測(cè)定的4個(gè)無(wú)刺花椒與畢君的研究結(jié)果存在一定差異，這可能是低溫處理方法不同所致。