消渴健脾膠囊中梔子苷的提取工藝優(yōu)化

朱曉東，張佳佳，王 瑩，蘭 衛(wèi)

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院， 新疆 烏魯木齊 830002；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

消渴健脾膠囊是由葛根、白術(shù)、大黃、車前子、茯苓、蒼術(shù)、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等十三味藥材組成的復(fù)方制劑，具有健脾燥濕、行氣和胃、祛濁化郁的功效。梔子具有利膽、鎮(zhèn)痛、降壓和抑菌抗炎的功效[1]，其主要成分有梔子苷、梔子苷酸、京尼平等[2]。研究表明，梔子苷具有抑菌[3]、利膽[4]、鎮(zhèn)痛[5]、保肝[6]、消炎[7]等作用。

消渴健脾膠囊中的蒼術(shù)、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等八味藥材采用水提取，葛根、白術(shù)、大黃、車前子、茯苓等五味藥材粉碎。水提取的藥材中梔子苷等成分為水溶性，具有較強的生物活性，故以梔子苷含量為提取工藝的評價指標(biāo)。

作者采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化消渴健脾膠囊中梔子苷的提取工藝，以最大程度保留梔子苷成分，從而保證消渴健脾膠囊的藥效。

1 實驗

1.1 藥材、試劑與儀器

葛根、白術(shù)、大黃、車前子、茯苓、蒼術(shù)、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜，購自安徽亳州中藥材飲片有限公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)姚藍副教授鑒定。

梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號：110749-200309)，中國藥品生物制品檢定所；乙腈，色譜純，Sigma公司;超純水。

Agilent 1200-DAD型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；KQ-200KD型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；AL204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇醫(yī)療儀器廠；DL-1型電子萬用爐，北京永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品0.62 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得0.062 mg·mL-1梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 梔子苷的提取

稱取蒼術(shù)23.0 g、茵陳23.0 g、梔子13.8 g、丹參23.0 g、土茯苓23.0 g、萊菔子34.5 g、厚樸13.8 g、木瓜34.5 g，加入一定量水浸泡30～60 min，煎煮2次，每次45 min，過濾，合并濾液，即得梔子苷提取液。

分別采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化梔子苷提取工藝條件。

1.2.3 供試溶液的制備

將梔子苷提取液濃縮定容至200 mL容量瓶中。取1 mL濃縮液用超純水定容至10 mL容量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，取續(xù)濾液作為供試溶液。

1.2.4 色譜條件與梔子苷含量的測定

色譜柱為Column XB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(15∶85，體積比，下同)，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為238 nm，進樣量為10 μL。

分別精密吸取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進行分析，測定梔子苷含量。消渴健脾膠囊按干燥品計算，梔子苷含量不得少于1.8%[8]。 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和供試溶液(b)的高效液相色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 煎煮時間對梔子苷含量的影響

將藥材按加水量10倍加水浸泡30～60 min，分別煎煮30 min、45 min、60 min、90 min，煎煮2次，測定梔子苷含量，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，煎煮45 min時，梔子苷含量最高。

2.1.2 加水量對梔子苷含量的影響

將藥材分別按加水量8倍、10倍、12倍、16倍加水浸泡30～60 min，煎煮2次，每次45 min，測定梔子苷含量，結(jié)果見圖3。

圖2 煎煮時間對梔子苷含量的影響

從圖3可以看出，加水量10倍時，梔子苷含量最高。

2.1.3 煎煮次數(shù)對梔子苷含量的影響

圖3 加水量對梔子苷含量的影響

將藥材按加水量10倍加水浸泡30～60 min，分別煎煮1次、2次、3次、4次，每次45 min，測定梔子苷含量，結(jié)果見圖4。

圖4 煎煮次數(shù)對梔子苷含量的影響

從圖4可以看出，煎煮2次，梔子苷含量最高。

2.2 正交實驗結(jié)果

以梔子苷含量為評價指標(biāo)，以煎煮次數(shù)(A)、煎煮時間(B)和加水量(C)為考察因素，采取L9(34)正交實驗進行梔子苷提取實驗，因素與水平見表1，正交實驗的結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表1 正交實驗的因素與水平

從表2、3可以看出，以梔子苷含量為評價指標(biāo)時，直觀分析結(jié)果顯示3個因素對提取工藝影響的順序為：煎煮次數(shù)>加水量>煎煮時間；方差分析顯示，煎煮次數(shù)對梔子苷含量有極顯著性影響，加水量對梔子苷含量有顯著性影響，煎煮時間對梔子苷含量無顯著性影響。因此，確定最佳提取工藝條件為A2B1C2，即加水量10倍、煎煮2次、每次30 min。

表2 正交實驗的結(jié)果與分析

表3 正交實驗的方差分析

2.3 驗證實驗

在最佳提取工藝條件下，平行煎煮藥材3份，測得梔子苷含量(mg·g-1)分別為0.279、0.286、0.281，平均值為0.282 mg·g-1，RSD值為1.28%。

經(jīng)過驗證實驗，現(xiàn)提取工藝與原工藝(加水量10倍、煎煮2次、每次45 min)相比，提取的梔子苷含量相當(dāng)，無顯著差異?，F(xiàn)提取工藝煎煮時間短，減少了高溫對梔子苷的損耗。

2.4 討論

煎藥用水應(yīng)選用潔凈澄清、無異味、雜質(zhì)及礦物質(zhì)含量少的水，一般生活飲用水即可。加水量應(yīng)視藥材的質(zhì)地、吸水量的多少、煎煮過程中的蒸發(fā)量及煎煮后所需的藥液量進行綜合考慮。加水量過少，藥材的有效成分不易煎出；加水量過多則煎煮時間勢必延長，使部分成分散失甚至破壞，正如《本草綱目》所云:“劑多水少，則藥味不出；劑少水多，又煎耗藥力”。實際應(yīng)用時，一般加水量為將飲片適當(dāng)加壓后，液面高出飲片約2 cm為宜。

中藥材大多是干燥品，有效成分多沉積于干涸、皺縮的藥材組織內(nèi)，為了縮短煎煮時間，便于有效成分的煎出，通常煎煮前須加水浸泡30～60 min，煎煮過程中應(yīng)根據(jù)藥材的質(zhì)地和藥物的性質(zhì)，控制火候及時間。一般煎藥宜先“武”后“文”，即用大火使藥液盡快沸騰， 然后改用小火保持微沸狀態(tài)30 min[9]。

本實驗選擇HPLC流動相時，首先采用了曲琰等[10]的條件，流動相為乙腈-水(13∶87)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長238 nm。然后，采用了賀鵬等[11]的條件，流動相為乙腈-水(15∶85)，柱溫40 ℃，流速0.7 mL·min-1，進樣量5 μL；康艷萍等[12]的條件，流動相為甲醇-水(25∶75)，流速：泵A 0.25 mL·min-1、泵B 0.75 mL·min-1，檢測波長240 nm，進樣量20 μL；王謙等[13]的條件，流動相為乙腈-水(10∶90)，流速1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃；朱慧慧等[14]的條件，流動相為甲醇-水(30∶70)，流速1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長240 nm，進樣量10 μL。以上條件都存在不出峰、分離度不達標(biāo)、色譜圖不達標(biāo)等問題，不適于消渴健脾膠囊中梔子苷含量測定。

本實驗確定的色譜條件：色譜柱為Column XB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(15∶85)，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為238 nm，進樣量為10 μL。在此色譜條件下，色譜圖達標(biāo)，分離度及理論塔板數(shù)良好。

3 結(jié)論

消渴健脾膠囊中的蒼術(shù)、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等八味藥材采用水提取梔子苷。以梔子苷含量為評價指標(biāo)，利用HPLC法測定梔子苷含量，采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化梔子苷提取工藝條件。確定優(yōu)化的提取工藝條件為：加水量10倍、煎煮2次、每次30 min，在此條件下，梔子苷含量為0.282 mg·g-1，正交實驗結(jié)果與驗證實驗結(jié)果一致。該提取工藝穩(wěn)定、可靠、可行，可為消渴健脾膠囊中梔子苷含量測定和質(zhì)量控制提供依據(jù)。