強骨飲調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞外泌體影響成骨細(xì)胞分化的初步研究

唐彬彬 劉康 吳連國 史曉林

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310005

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)和成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)分化動態(tài)平衡失調(diào)的病理狀態(tài)。研究報道，OC來源的外泌體可通過傳遞micro-RNA(以下稱miRNA)至OB中抑制OB分化，進一步加重OP[1]。Wnt/β-catenin通路可促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向OB方向分化，負(fù)責(zé)OB的增殖和分化，也可抑制OC分化，在骨生長和骨密度維持中具有重要調(diào)控作用[2-3]。miRNA與wnt/β-catenin通路關(guān)系密切，可調(diào)控OB分化增殖。中藥復(fù)方強骨飲治療原發(fā)性I型骨質(zhì)疏松癥具有促進OB活性，增加骨量，抑制OC活性，減少骨吸收的多靶點特點[4-5]?；谝陨涎芯浚狙芯繑M初步研究強骨飲含藥血清改善破骨細(xì)胞外泌體影響成骨細(xì)胞分化的內(nèi)在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

12周齡清潔級雌性SD大鼠10只(批號：SYXK鄂，2018-0101)，體重在280～300 g。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1試劑：巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF，PEPROTECH，315-02)，核因子κ B受體活化因子配體(RANKL，R&D，462-TR-010)，小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW 264.7，武漢普諾賽，CL-0190)，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC，武漢普諾賽，CP-M131)，成骨誘導(dǎo)液(賽業(yè)生物，MUCMX-90021)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(TRAP，碧云天，P0332)，堿性磷酸酶測試盒(ALP，南京建成，A059-2)，外泌體抗體CD9(Abcam，ab92726)、CD63(Abcam，ab217345)、CD81(Abcam，ab109201)，β環(huán)狀蛋白(β-catenin，Abcam，ab16051)。

1.2.2儀器：倒置拍照顯微鏡(Leica，IX51)，垂直電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-24DN)，水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，TS-1)，磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器，T8-1)。

1.3 含藥血清制備

將大鼠隨機分為2組：對照血清組和含藥血清組。一副藥濃縮至22.2 mL(含生藥量245 g，包含防風(fēng)15 g、黃芪30 g、忍冬藤25 g、露蜂房20 g、杜仲15 g、肉桂10 g、川芎20 g、川續(xù)斷30 g、骨碎補20 g、雞血藤25 g、秦艽15 g、鹿角霜20 g)，參考臨床成人用量換算成大鼠后的10倍劑量，并按體表面積換算，大鼠所需藥量為70 kg成人的6.3倍，即每千克大鼠每天灌胃劑量：245 g/70 kg×6.3×10=220.5 g/kg。大鼠灌胃劑量為20 mL/(kg·d)，每天灌胃兩次[每次灌胃量為10 mL/kg(含生藥量110.25 g)]，對照血清組采用生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃3 d，最后一次給藥后1～2 h采血(摘眼球取血，無菌操作)。分離血清，于56 ℃水浴滅活30 min，以0.22 μm濾器滅菌消毒，置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 構(gòu)建OC和OB分化模型

構(gòu)建OC模型采用M-CSF(20 ng/mL)、RANKL(50 ng/mL)處理RAW264.7細(xì)胞進行誘導(dǎo)；構(gòu)建OB模型采用成骨誘導(dǎo)液處理的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)進行誘導(dǎo)。

1.5 實驗指標(biāo)檢測方法

1.5.1OC模型TRAP染色。設(shè)1組為單純RAW264.7細(xì)胞，2組為OC模型加入對照血清，3組為OC模型加入含藥血清。對照血清和含藥血清另設(shè)2%、5%、10%、15%和20% 5種血清濃度，血清處理3 d。細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)束后，每孔(96孔板，每孔5 000個細(xì)胞)加入100 μL TRAP工作液，每組細(xì)胞37 ℃避光孵育10 min，棄掉染色液，顯微鏡拍照。

1.5.2OC來源外泌體提取。設(shè)1組為OC模型加入15%濃度對照血清；2組為OC模型加入15%濃度含藥血清。兩組以5×105/mL的細(xì)胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，處理7 d后，去除上清液，更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后收集兩實驗組外泌體，1組外泌體稱為Exo-Con，2組外泌體稱為Exo-Drug。

1.5.3外泌體表達(dá)及β-catenin蛋白檢測。采用免疫印跡試驗法(Western blot，WB)進行對CD9、CD63、CD81和β-catenin蛋白表達(dá)檢測。檢測β-catenin在總蛋白、細(xì)胞核中的含量，總蛋白以GAPDH為內(nèi)參，細(xì)胞核以laminB為內(nèi)參。細(xì)胞裂解后測定蛋白質(zhì)濃度，并致于-80 ℃保存。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。封閉液稀釋相應(yīng)的一抗(GAPDH：1∶1000稀釋，CD9∶1∶1000稀釋，CD63∶1∶1000稀釋，CD81∶1∶1000稀釋，LaminB：1∶1500稀釋，β-catenin：1∶1500稀釋)，PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1∶5000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。將ECL試劑中增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，反應(yīng)數(shù)分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，顯影儀拍照。

圖1 RAW264.7細(xì)胞的TRAP染色 A：對照組，無任何處理；B：加入M-CSF和RANKL誘導(dǎo)破骨與不同濃度對照血清；C：加入M-CSF和RANKL誘導(dǎo)破骨與不同濃度含藥血清(**P<0.01)。Fig.1 TRAP staining of RAW264.7 cells. A: Control group, without any treatment; B: Adding M-CSF and RANKL to induce osteoclast and control serum with different concentrations; C: Adding M-CSF and RANKL to induce osteoclast and different concentrations of drug containing serum (**P< 0.01).

1.5.4ALP檢測。設(shè)1組為小鼠BM-MSC，2組為OB模型，3組為OB模型加入Exo-Con，4組為OB模型加入Exo-Drug。各組吸取培養(yǎng)液，離心取上清液備用；配制酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。采用ALP試劑盒，空白管加入雙蒸水30 μL，標(biāo)準(zhǔn)管0.1 mg/mL酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液30 μL，測定管加入各組待測樣本30 μL，均加入緩沖液，基質(zhì)液，充分混勻 37 ℃孵育15 min加入顯色劑，520 nm波長測定各孔吸光度。定義1 mL液體在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.5.5基因提取和基因表達(dá)檢測。收集OB模型細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗3次，1 500 r/min離心3 min收集細(xì)胞，以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板中。使用總RNA提取試劑盒提取RNA；提取的RNA進行mRNA逆轉(zhuǎn)錄程序，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為PCR擴增模板。RT-PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性，95 ℃，10 min；變性，95 ℃，15 s；退火，60 ℃，30 s；延伸，72 ℃，30 s，40個循環(huán)。引物信息：成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)：

F-5’-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3’，R-5’-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3’；

骨橋蛋白(OPN)：F-5’-CTTTCACTCC AATCGTCCCTAC-3’，R-5’-GCTCTCTTTGGAATGC TCAAGT-3’；

骨鈣素(OCN)：F-5’-AGCAGGAGGGCAA TAAGGTAGT-3’，R-5’-ACCGTAGATGCGTTTGTA GGC-3’；

內(nèi)參抗體(Gapdh)：F-5’-GTATGACTCCA CTCACGGCAAA-3’，R-5’-GGTCTCGCTCCTGG AAGATG-3’。

1.5.6Wnt/β-catenin通路檢測：設(shè)1組為RAW264.7細(xì)胞；2組為OC模型加入15%對照血清；3組為OC模型加入15%含藥血清；4組為小鼠BM-MSC；5組為OB模型；6組為OB模型加入Exo-Con；7組為OB模型加入Exo-Drug。1～3組：M-CSF和RANKL處理4 d后，進行血清處理3 d；4～7組：誘導(dǎo)11 d時，加入外泌體，處理3 d。每組以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板中采用WB法檢測β-catenin，方法于1.5.3中說明。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件，計量數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)，采用t檢驗。計數(shù)資料采用Krusal-Wallis檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 強骨飲含藥血清對OC模型分化的影響

M-CSF和RANKL誘導(dǎo)處理增加OC模型的TRAP活性，促進破骨分化，而含藥血清可以抑制TRAP活性，抑制破骨分化。15%和20%的含藥濃度抑制破骨分化效果較佳(圖1)。

2.2 外泌體蛋白檢測

空白血清和含藥血清處理后的OC模型外泌體均表達(dá)CD9、CD63、CD81蛋白，表明外泌體提取和分離效果較好(圖2)。

圖2 RAW264.7細(xì)胞外泌體的蛋白檢測Fig.2 Protein detection of exosomes in RAW264.7 cells注：Exo-con為加入對照血清的OC外泌體；Exo-Drug為加入含藥血清的OC外泌體；CD9、CD63、CD81為外泌體抗體。

2.3 外泌體對OB模型ALP活性的影響

OB模型促進ALP活性增加，加入外泌體Exo-Con和Exo-Drug均抑制ALP活性，但Exo-Drug對ALP抑制作用弱于Exo-Con。表明外泌體抑制OB分化，加入含藥血清降低對OB分化的抑制作用(圖3)。

圖3 BM-MSC細(xì)胞上清液中ALP活性檢測Fig.3 Detection of ALP activity in the supernatant of BM-MSC cells注：4組ALP表達(dá)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 外泌體對OB模型成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

OB模型均能促進OCN、OPN、RUNX2基因轉(zhuǎn)錄，加入外泌體Exo-Con和Exo-Drug均抑制OCN、OPN、RUNX2基因轉(zhuǎn)錄，但Exo-Drug對OCN、OPN、RUNX2基因轉(zhuǎn)錄抑制作用弱于Exo-Con。表明外泌體抑制OB分化，破骨分化誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞外泌體抑制BM-MSC的成骨分化，加入含藥血清降低對OB分化的抑制作用(圖4)。

圖4 BM-MSC細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因檢測 A：4組OCN表達(dá)檢測，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；B：4組RUNX2表達(dá)檢測，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；C：4組OPN表達(dá)檢測，加入對照血清和含藥血清OC外泌體表達(dá)無差異，其余比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(**P<0.01)。Fig.4 Detection of osteogenic differentiation-related factors in BM-MSC cells. A: There were significant differences in the expression of OCN in 4 groups; B: Runx2 expression in 4 groups was statistically significant; C: There was no difference in the expression of OC exosomes in control serum and drug containing serum in group 4, and the other differences were statistically significant (**P<0.01).

2.5 強骨飲含藥血清對wnt/β-catenin通路的影響

M-CSF和RANKL誘導(dǎo)處理的OC模型抑制wnt/β-catenin通路(總蛋白和細(xì)胞核中含量減少)，而含藥血清則激活β-catenin通路(總蛋白和細(xì)胞核中含量增加)；OB模型激活wnt/β-catenin通路(總蛋白和細(xì)胞核中含量增加)，外泌體Exo-Con和Exo-Drug均抑制β-catenin通路，但Exo-Drug對β-catenin通路抑制作用弱于Exo-Con(圖5)。

圖5 RAW264.7與BM-MSC細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白檢測Fig.5 Detection of β-catenin in RAW264.7 and BM-MSC cells注：Total為細(xì)胞總蛋白內(nèi)含量；nucleus為細(xì)胞核內(nèi)含量；GAPDH與LaminB為內(nèi)參蛋白。

3 討論

強骨飲為浙江省名中醫(yī)史曉林教授經(jīng)驗方，已運用臨床10余年。在動物研究中證實，強骨飲可以有效增加骨量，促進鈣質(zhì)沉積的作用[4-5]；臨床運用中，強骨飲在防治原發(fā)性I型骨質(zhì)疏松癥、提高骨量、緩解疼痛等方面存在顯著療效。眾所周知，抑制OC分化和促進OB分化是治療OP的基本原則。臨床上大多采用骨吸收抑制劑治療原發(fā)性I型骨質(zhì)疏松，而中醫(yī)藥防治OP具有多靶點的特點。本研究為探究中藥復(fù)方強骨飲的雙向調(diào)控機制，選擇觀察可聯(lián)系OC和OB的外泌體和wnt/β-catenin通路進行研究。

外泌體是一種細(xì)胞分泌的囊泡，內(nèi)含組織或者細(xì)胞特異性蛋白、脂質(zhì)和核酸片段，具有一定的細(xì)胞間信使作用，能通過水平轉(zhuǎn)移或細(xì)胞-受體相互作用來進行內(nèi)容物的傳遞，調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的功能，在疾病發(fā)生發(fā)展及診斷中起著重要作用[1，6]。2016年Nature Communication上報道，OC來源的外泌體可通過傳遞miR-214-3p至OB中抑制OB分化，OC miR-214-3p高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠骨形成受到抑制[1]。肌細(xì)胞源性外泌體可通過miR-27a-3p增強成骨分化能力[6]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可促進成骨分化抑制OP[7]。礦化的OB外泌體通過miRNA抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Axin1表達(dá)激活wnt/β-catenin通路從而誘導(dǎo)成骨分化[8]。因此，OC外泌體在成骨分化過程中扮演重要角色，而強骨飲抑制OP是否與外泌體以及miRNA相關(guān)，則有待研究。

本研究首先對M-CSF和RANKL誘導(dǎo)處理的RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建OC模型，分別用強骨飲藥物和對照藥物進行干預(yù)。采用TRAP染色證實強骨飲可以抑制OC分化，找到最佳的含藥血清濃度。其次，使用最佳含藥血清濃度干預(yù)OC模型，進行OC來源外泌體檢測，發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組均能提取外泌體，說明強骨飲對OC外泌體的釋放沒有影響。收集外泌體干預(yù)成骨誘導(dǎo)液的小鼠BM-MSC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)強骨飲干預(yù)下的OC外泌體作用于OB模型，相比于對照組，能緩解對BM-MSC細(xì)胞成骨分化的抑制作用。通過檢測ALP含量，OCN、OPN、RUNX2因子表達(dá)提供了證據(jù)。然而，相比于未加入外泌體的實驗組，OB分化未受到明顯抑制。本研究證實了OC模型外泌體影響OB分化，但強骨飲可改善這種影響。為了進一步探究干預(yù)機制，展開了對wnt/β-catenin通路的相關(guān)研究。

Wnt/β-catenin通路負(fù)責(zé)OB的增殖和分化[9]，可促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向OB分化，抑制其向軟骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞分化，并抑制OB凋亡，從而促進骨形成[9]。研究報道，黃芪皂苷I(強骨飲君藥成分)可刺激成骨分化，且依賴于wnt/β-catenin通路[10]。印度黃檀異黃酮可激活BMP2-wnt/β-catenin通路誘導(dǎo)成骨分化促進骨生長緩解骨質(zhì)疏松，該誘導(dǎo)作用可被wnt受體阻斷劑DKK1和TCF復(fù)合物抑制劑FH535所阻斷[11]。Wnt受體阻斷劑DKK1含量在卵巢切除的骨質(zhì)疏松模型大鼠中顯著增加[3]，說明wnt/β-catenin通路也可抑制OC分化。研究發(fā)現(xiàn)強骨飲干預(yù)OC時，總蛋白和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin顯著增加，說明強骨飲可激活wnt/β-catenin通路來抑制OC分化；而在OB中，β-catenin含量受外泌體影響減少，但含藥血清可減弱對通路的抑制作用。表明了基于wnt/β-catenin通路強骨飲具有雙向調(diào)控的作用機制。

然而，對OC來源外泌體抑制OB分化如何影響wnt/β-catenin通路的內(nèi)在聯(lián)系仍不明確，需要進一步研究。文獻報道，wnt/β-catenin與miRNA關(guān)系密切。miR-433-3p可靶向結(jié)合DKK1 mRNA UTR端，促進DKK1 mRNA降解，降低DKK1蛋白含量，從而促進成骨細(xì)胞分化[3]。miR-194通過抑制wnt負(fù)向調(diào)控子SUFU激活wnt/β-catenin通路[12]。miR-29c-3p通過靶向結(jié)合Dvl2 mRNA 3’UTR從而調(diào)節(jié)wnt/β-catenin通路調(diào)控成骨分化[13]。此外，miR-141、miR-22、miR-185等均可通過調(diào)節(jié)wnt/β-catenin通路影響成骨分化[14-15]。目前，中藥黃芪主要成分通過miRNA影響大鼠細(xì)胞癌變和心肌細(xì)胞缺血的研究已提示中藥與miRNA的關(guān)系[16-19]。進一步研究強骨飲與miRNA關(guān)系，為闡明強骨飲對wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)機制具有創(chuàng)新性和可行性。

通過設(shè)置強骨飲含藥血清和對照血清進行細(xì)胞干預(yù)，初步證實了含藥血清可以抑制OC分化，能促進OC細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)。同時，觀察到OC細(xì)胞可以釋放外泌體抑制成骨細(xì)胞分化，而強骨飲含藥血清可以改善破骨細(xì)胞外泌體的抑制作用。在堿性磷酸酶、相關(guān)成骨因子和β-catenin蛋白表達(dá)上得到了驗證。更重要的是，本研究假說上述變化可作用于wnt/β-catenin通路進行調(diào)節(jié)，這與外泌體傳遞miRNA作用相關(guān)靶基因有密切聯(lián)系。