異丙酚預處理通過上調(diào)Caveolin-3 增加缺血心肌細胞線粒體膜穩(wěn)定性的機制研究

田香，鄧德傳，蘭運輝，楊坤渹

作者單位：1湖北民族大學附屬民大醫(yī)院麻醉科，湖北 恩施 445000；2巴東縣民族醫(yī)院，湖北 恩施 444324

心肌缺血損傷是圍手術(shù)期發(fā)病率和死亡率的主要原因［1］。在目前可用的干預措施中，藥理學方法仍然是挽救受損心臟組織的有效替代方法［2］。作為一種廣泛使用的靜脈麻醉劑，異丙酚已被證明對心肌缺血損傷的心肌細胞具有保護作用［13］。盡管已經(jīng)提出了幾種假設(shè)來解釋其心臟保護作用，但到目前為止，確切的機制還沒有完全闡明，因為它們是多因素的和復雜的。除了改善氧化應激和維持線粒體功能外，PI3K/Akt通路通常被認為與異丙酚誘導的心臟保護作用有關(guān)［4］?；钚匝酰≧eactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的增加是心肌缺血損傷的關(guān)鍵事件之一［5］。過量的ROS產(chǎn)生導致線粒體損傷，包括線粒體膜電位的損失，并導致細胞凋亡［6］。因此，抑制ROS產(chǎn)生和保護線粒體免受氧化損傷是改善心肌缺血損傷的有效策略［7］。Caveolin-3，一種內(nèi)源性分子和細胞膜穴樣內(nèi)陷的主要結(jié)構(gòu)蛋白，據(jù)報道具有心臟保護作用［8-9］。Caveolin-3在心臟保護中的作用可見于Caveolin-3基因敲除小鼠中藥理學預處理的抗性升高，以及具有心臟特異性Caveolin-3過表達的小鼠中細胞凋亡的減少［10-11］。此外，Caveolin-3具有許多支架結(jié)構(gòu)域錨定多種信號分子如G蛋白，PI3K等，Caveolin-3也可作為 PI3K/Akt 的支架蛋白［12］。Caveolin-3 已被證實在揮發(fā)性麻醉藥和阿片類藥物引起的心臟保護中發(fā)揮了重要作用［13］。然而Caveolin-3是否參與心肌缺血期間異丙酚誘導的心肌保護及其潛在機制沒有報道。本研究自2019年8—12月檢查異丙酚是否通過上調(diào)Caveolin-3降低心肌缺血病人線粒體膜穩(wěn)定性。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 篩選健康SD 大鼠36 只，體質(zhì)量范圍為250～300 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。本研究動物處置符合動物倫理學要求。

1.2 分組 36只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組，每組12 只。①正常心肌細胞組：僅開胸不結(jié)扎；②心肌缺血再灌注組：單純給予以5%葡萄糖稀釋的脂肪乳，持續(xù)靜脈滴注；③缺血心肌細胞+異丙酚預處理組：缺血前10 min開始持續(xù)靜脈滴注異丙酚12 mg·kg-1·h-1，異丙酚用5%葡萄糖稀釋。

1.3 心肌缺血再灌注造模 麻醉開胸，在動脈下穿3-0 的絲線，其末端套直徑2 mm、長2 cm 的聚乙烯管，拉緊絲線以阻斷冠脈血流，心臟表面青紫。松開絲線，即可恢復血流，心臟表面明顯充血。缺血30 min，再灌注2 h。

1.4 心肌細胞制備 在其心臟跳動時將心臟取下，小心剪取心室組織，用冰PBS液清洗干凈后，將組織反復剪成0.5～1 mm3的小塊，加2～3 滴細胞培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打后分次吸取組織塊懸液，將其均勻排在75 mL培養(yǎng)瓶底壁上。

1.5 制備全細胞提取物及蛋白質(zhì)印跡分析 將心肌細胞用冷PBS 洗滌2 次并浸入裂解緩沖液（上海碧云天公司）（組合物：50 mmol/L HEPES，pH 7.4，0.1%Chaps，5 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA 和0.1%Triton X-100）中。離心細胞裂解物。通過Bradford Protein Assay Kit（上海碧云天公司）測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。將等量樣品上樣并通過12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠（上海碧云天公司）電泳分離。通過電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。將膜在5%脫脂乳中在室溫下封閉1 h。與第一抗體一起孵育在4 ℃開始過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)第二抗體2 h。用ChemiDocXRS 顯現(xiàn)免疫印跡，并用LabImage軟件分析。

1.6 測量細胞內(nèi)ROS 通過熒光探針DCFH-DA（美國Sigma公司）測定ROS產(chǎn)生。細胞可滲透的非熒光DCFH-DA在ROS存在下氧化成高度熒光的2，7-二氯熒光素。將心肌細胞鋪板在六孔板上，進行心肌缺血處理。通過胰蛋白酶消化收獲細胞。在2次PBS 洗滌后，在37 ℃在黑暗中加入10 μmol/L DCFH-DA（上海碧云天公司）20 min。通過流式細胞術(shù)在488 nm 的激發(fā)波長和525 nm 的發(fā)射波長下測量熒光強度。

1.7 線粒體膜電位的測量 通過陽離子染料JC-1（上海碧云天公司）評估線粒體膜電位。在正常細胞中，JC-1 在線粒體中聚集，發(fā)紅色熒光。在凋亡細胞中，JC-1在胞質(zhì)溶膠（美國Sigma公司）中累積，作為綠色熒光單體。在實驗結(jié)束時，通過胰蛋白酶消化收獲1×106個細胞。在兩次PBS 洗滌后，將細胞與 JC-110 μg/mL 在 37 ℃在黑暗中溫育15 min。收獲細胞，懸浮于PBS中，并通過流式細胞術(shù)分析。

1.8 心肌細胞凋亡 通過半胱天冬酶（caspase）比色測定試劑盒（上海碧云天公司）測定心肌細胞caspase-3和caspase-9活性。將心肌組織在冰冷的裂解緩沖液中勻漿30 s。將勻漿物離心。收集上清液，通過二辛可寧酸法測量蛋白質(zhì)濃度。向96 孔板的每個孔中加載含有200 μg 蛋白質(zhì)的上清液，并在37 ℃下與25 μg caspase-3 和caspase-9 底物N-乙?；?Asp-Glu-Val-Asp-p-硝基苯胺（上海碧云天公司）一起溫育1.5 h。用SpectraMax-Plus 微孔板分光光度計在405 nm 下測量光密度。使用標準曲線計算caspase-3和caspase-9活性，并表示為相對于對照的平均值的倍數(shù)增加。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 異丙酚上調(diào)Caveolin-3 水平 蛋白質(zhì)印跡實驗顯示，心肌缺血再灌注組Caveolin-3蛋白降低，異丙酚改善心肌缺血誘導的Caveolin-3 下調(diào)（P＜0.05）。見圖1，表1。

2.2 流式細胞術(shù)檢測ROS 的產(chǎn)生 通過流式細胞術(shù)確定DCF 熒光強度來評估細胞內(nèi)ROS 水平。心肌缺血再灌注組DCF 熒光增加（P＜0.05）。缺血心肌細胞+異丙酚預處理組心肌細胞DCF 熒光降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 Caveolin-3蛋白質(zhì)印跡實驗

2.3 異丙酚增加線粒體膜電位，并減少細胞色素C釋放 線粒體膜電位是線粒體凋亡途徑的重要早期決定因素。我們研究了異丙酚對線粒體膜電位和細胞色素C釋放的影響。利用JC-1染料進行線粒體膜電位檢測以評估線粒體膜去極化。與對照相比，經(jīng)受心肌缺血的心肌細胞顯示出線粒體去極化降低（P＜0.05）。缺血心肌細胞+異丙酚預處理組穩(wěn)定了線粒體膜電位（P＜0.05）。線粒體去極化釋放幾種凋亡蛋白，細胞色素C 進入胞質(zhì)溶膠。蛋白質(zhì)印跡分析表明心肌缺血增加線粒體細胞色素C釋放到胞質(zhì)溶膠中，缺血心肌細胞+異丙酚預處理組降低細胞色素C釋放（P＜0.05）。見表1。

2.4 異丙酚降低心肌缺血病人caspase-3和caspase-9活性 細胞凋亡是短時間缺血后立即再灌注后細胞死亡的主要機制，caspase-3和caspase-9活性是心肌細胞凋亡的非常特異的指標。心肌缺血再灌注組顯示出 caspase-3 和 caspase-9 活性增加（P＜0.05）。與心肌缺血再灌注組相比，異丙酚降低了caspase-3和caspase-9活性（P＜0.05）。見表1。

3 討論

證據(jù)表明，Caveolin-3 可以緩解心肌缺血損傷。例如，誘導心肌細胞中Caveolin-3的特異性過表達模擬缺血誘導的心肌保護作用，而心臟Caveolin-3敲除消除了異丙酚的心臟保護作用［14］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Caveolin-3對異丙酚相關(guān)的心臟保護也很重要。異丙酚不僅可以保護心臟免受心肌缺血的損傷，還可以防止心肌缺血病人Caveolin-3下降。

鑒于失調(diào)的蛋白質(zhì)降解可能導致心肌缺血損傷中蛋白質(zhì)水平的變化，我們猜測蛋白酶體途徑是否是心肌缺血誘導的Caveolin-3 蛋白質(zhì)下調(diào)的原因。我們觀察到心肌缺血中Caveolin-3 表達降低，異丙酚處理Caveolin-3表達升高。這些結(jié)果表明蛋白酶體途徑可能在心肌缺血損傷下Caveolin-3下調(diào)中起作用。異丙酚在心肌缺血下維持Caveolin-3蛋白水平的作用可能有助于其對蛋白酶體途徑相關(guān)的Caveolin-3降解的抑制作用。蛋白酶體普遍存在于哺乳動物細胞中，并且是主要的非溶酶體蛋白酶復合物，其負責大多數(shù)細胞內(nèi)短壽命蛋白質(zhì)的降解［15］。蛋白酶體在心臟心肌缺血損傷中的作用是一個新興的領(lǐng)域。心臟心肌缺血引起蛋白酶體失能，這是特異性而非全局性的，關(guān)鍵抗氧化基因的蛋白酶體激活基本上不受影響。另一方面，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的藥理學阻斷賦予心肌缺血損傷的心臟保護作用，即在一定條件下，增強心肌抗氧化防御，減輕炎癥，增加自噬反應。

表1 三組大鼠Caveolin-3蛋白、DCF熒光強度、線粒體膜電位、細胞色素C、caspase-3和caspase-9活性比較/

表1 三組大鼠Caveolin-3蛋白、DCF熒光強度、線粒體膜電位、細胞色素C、caspase-3和caspase-9活性比較/

注：與正常心肌細胞組比較，aP＜0.05；與心肌缺血再灌注組比較，bP＜0.05

caspase-9/U 0.84±0.06 2.25±0.21ab 0.93±0.11a 16.125 0.006組別正常心肌細胞組心肌缺血再灌注組缺血心肌細胞+異丙酚預處理組F值P值鼠數(shù)12 12 12 Caveolin-3 2.24±0.25 0.57±0.09ab 2.02±0.14a 13.274 0.013熒光強度1.00±0.12 2.79±0.21ab 1.23±0.14a 15.347 0.005線粒體膜電位1.00±0.06 0.13±0.02ab 0.83±0.11a 16.532 0.014細胞色素C 1.00±0.08 2.76±0.24ab 1.37±0.18a 12.195 0.025 caspase-3/U 1.23±0.14 3.46±0.21ab 1.47±0.13a 15.384 0.008

在生理條件下，自由基生成與內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)之間存在著重要的平衡。諸如缺血和再灌注的病理狀況傾向平衡，有利于ROS 過量產(chǎn)生，增加氧化應激，主要的凋亡刺激。抑制ROS 形成或拮抗ROS 毒性的藥物對再灌注損傷的心肌具有保護作用。在目前的研究和許多其他研究中，心肌缺血損傷引起梗死和心功能不全。異丙酚減弱了經(jīng)受心肌缺血的細胞損傷。

心肌細胞凋亡是心肌缺血損傷的主要致病機制之一。有證據(jù)表明，與再灌注毒性有關(guān)的ROS可通過線粒體凋亡途徑引發(fā)心肌細胞凋亡［16］。在心肌再灌注早期釋放的ROS強烈氧化已經(jīng)被缺血損傷的心肌細胞。心肌細胞富含線粒體，這是一種主要的內(nèi)源性來源，也是ROS損傷的易感靶點。線粒體介導的細胞凋亡在心肌缺血損傷發(fā)病機制中起重要作用。在正常條件下，細胞色素C位于線粒體內(nèi)。在細胞內(nèi)ROS過量產(chǎn)生期間，線粒體膜電位的崩潰導致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，并且快速釋放細胞色素C進入細胞質(zhì)。一旦釋放，細胞色素C結(jié)合凋亡蛋白酶激活因子-1（Apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1）的C 末端結(jié)構(gòu)域，誘導構(gòu)象變化?；罨腁paf-1/細胞色素C復合物促進caspase活化。半胱天冬酶轉(zhuǎn)導并執(zhí)行凋亡信號傳導。caspase-3（末端常見的凋亡途徑）也被激活，caspase-9被線粒體介導的凋亡途徑激活。在目前的研究中，我們證明異丙酚預處理減輕了心肌缺血誘導的細胞內(nèi)ROS，線粒體膜電位和細胞色素C線粒體釋放到胞質(zhì)溶膠中，表明線粒體途徑參與異丙酚介導的心臟保護作用。

綜上所述，我們的研究表明異丙酚在心肌缺血下的保護作用取決于Caveolin-3 的上調(diào)，后者降低活性氧產(chǎn)生、增加線粒體膜電位、減少細胞凋亡和細胞色素C釋放。